腺病毒的包装，纯化和感染

名山大川

腺病毒的包装，纯化和感染
  F" n8 D! n" ]+ e+ C7 M技术背景：Adeasy系统利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度浓缩等优点，4 e: y& ~: K* j9 `6 p
并破坏了腺病毒基因组中的早期基因E1，使之成为较为安全、高效的病毒载体。
$ a& d- K- N. u  a+ d8 c利用带有 E1 基因的 293 细胞作为包装细胞，通过倍比扩增，富集病毒颗粒，并
- k; f3 D# i6 i通过CsCl 梯度离心，透析进行分离纯化。对绝大多数的细胞株可以达到近乎100
( Y2 v" Z1 A1 U6 x0 F# O  U％的感染效率。但需要指出的是 Adeasy 同样具有所有病毒载体或转染试剂都不
4 L% J3 Q8 ^3 c% q& b可避免的细胞毒性问题。
8 A4 m; V* L' x, |; G$ \! \所需试剂：8 l% J1 G1 m8 B, i& a
? 293细胞；* l7 j  p& \+ `! {- r8 k( u
? 重组好的腺病毒质粒；
+ _7 D- R$ B- Y0 o6 ?9 j- y6 @? Pac I限制性内切酶；
6 j, A4 v* c/ F- c? 质粒回收相关试剂；7 N9 q: x8 @9 e* o; n
? 细胞培养、转染相关试剂；8 G' H5 y" y+ `& r7 _* Y( X
? TBS：10mMTris, 0.9% NaCl,pH8.1;
. T! @$ @) E& G! }9 x% i* E? 40%CsCl：28.45gCsCl 溶于42.7ml 的TBS 中，4度保存；
( j. B( p7 \' N# M3 Y( e? 15%CsCl：9.085gCsCl 溶于47.69ml 的TBS 中，4度保存；4 a. C1 W( B+ M4 q% O/ Y* o- r
? Beckman 离心管：14*89 mm，SW41 转头；
; f7 Z1 ^  j7 _4 |? Polybrene(sigma)，10 mg/ml；
; G  m* u6 G9 w# e2 b? 透析袋：Spectrum Co. （成卷供应，带少量甘油，硫化物与重金属），
7 N, l' M6 _( Z7 p  f- PMW=8000~14400；
3 d& k* S2 c0 f? 灭菌甘油。
: Z, ^" \: X& L. q- T, B操作流程：
  a( q& ~1 ^+ I' B) ]1. 293细胞（E1-transformedhumanembryonickidneycells 在转染前24小时接种3 H& f# v, [  S. k) |( g0 j1 }0 f4 U! i
于1或2个60mm 培养盘中，使之在转染时细胞汇合率为50-70%；
- B6 |! e# t0 |# U, r& A" t2. 在转染前，用Pac I处理目的质粒（一般一个60mm 细胞盘需要6μgDNA）。
; b$ P& b/ [) `. f/ _处理后质粒用乙醇沉淀并重悬于20μl 无菌水中；
7 e0 f- m% N$ w0 b+ d; s' F3. 用PEI或其他转染试剂将6μgPac I处理过的质粒转染细胞；8 P/ N  v& N" P. q% Y- G8 K
1# N& M% Q- W/ r! L

0 g+ S) D# P& P. r& |7 a4. 8 个小时后移去混合液，加入 4 ml DMEM 完全培养液（10% CBS，1%
1 j+ U& e0 x: b  a$ O1 ePen/Strep）；+ {  A* o& {% F6 F" q" B
5. 在转染后 7 到 10 天用细胞刮（而不是胰酶）将细胞从瓶中刮下并移入 50ml
9 {/ o, p8 ~  N' q8 ^0 W锥形管。离心后将细胞重悬于2.0ml PBS 或全培液中。于液氮中冻结细胞，
( m/ z5 a! Y: X" \# b, q8 f1 w/ v37℃水浴中溶解，剧烈振荡。此步骤共进行4 次。注意保存时不要反复冻融，4 P4 d/ b1 r0 a* v6 y
可保存于-20℃；/ Z+ r8 L, I4 ?7 z9 Y* J
6. 将293细胞以50-70%的汇合率铺于60mm 培养盘中，以30-50%的体积比加2 T5 Z" S' c: G/ v* p
入含病毒上清液。在感染后2-3天即可看到明显的细胞裂解或CPE现象；
7 T, A( D( x8 U/ H* y/ \; ^0 [7. 在有 1/3 到 1/2 的细胞脱离漂浮时，通常是感染后 3-5 天收集病毒。可进一7 f' {( K$ v  ~) c) R1 ^" `. Y
步通过Westernblot 或PCR（5μl 病毒上清加上10μl PCR-gradeProteaseK，
- y1 S7 t0 A8 o55℃消化1小时，然后煮沸样品5min，离心后取1-2μl 进行PCR反应）证2 z  M0 b% T8 \" T
实重组腺病毒的存在；. h2 H, m5 ^9 o
7
1 b- _2 ]5 U0 s  d1 f, U/ @- w4 {$ Z8. 按步骤5的方法收集病毒上清。在这种情况下一般至少可收集到10 infectious
' I8 A% w8 n- ^1 y" f+ Jparticles/ml 的病毒。每轮的扩增应能提高一个数量级的梯度；
1 S6 M! ^! C6 M, y% P2 O) ?6 m' o9. 为了进一步扩增，将步骤8获得的病毒上清进一步感染100 mm 培养盘的细
  V" Q+ x/ W$ U! M$ E2 _5 [胞，按步骤5的方法收集病毒，并进而将其感染150mm 细胞培养盘中的293
1 U. h, c& `2 w* H, ~- R6 l细胞，以获得足够量的病毒；7 h7 K' h% l; d
10. 将15%CsCl 和40%CsCl 加入Beckman 离心管中制备CsCl 梯度溶液；
& ]4 G0 u5 l& b# z11. 将最终富集病毒颗粒的病毒上清滴加于CsCl梯度溶液上；
+ {4 H" t6 q$ @3 n/ ]" d12. 超速离心，30000rpm，4度离心16个小时；
: F4 Y* J  [: S, r# @( w13. 离心后，应有两条带。位置较高，颜色较弱的条带主要为腺病毒空壳，不具0 c% m( ^' ^$ e
感染能力；位置较低，颜色较亮的条带含有我们需要收集的活病毒颗粒。用
# G. B& o+ y0 S16号针头将这一条带收集；9 l0 B* B1 D2 u
14. 在TBS 中透析一小时，随后在含有10％甘油的TBS 中透析两次，每次一小2 k( d! X3 A5 \) F* N+ S. N- e
时；& h* b6 G+ B2 [- A# T, V
15. 将纯化的腺病毒分装于EP 管中；
" k7 ~3 [4 w/ s( l16. 在Eppendorf Biophotometer中测量透析液中的总蛋白量，1μg病毒蛋白相当6 K. W% h6 Y' S2 j' K+ W( T
于4×109病毒颗粒；2 e: O% K) T( v, ]9 v2 @, O
17. 长期保存于-70度中，短期可保存于4度，切忌反复冻溶；
6 F% W0 Z, p1 W2) I; ^+ d$ j3 A' {% Z

. X, G0 y) D0 Y+ ~3 N" A18. 由于腺病毒对不同细胞株的感染效率存在差异，且考虑到病毒颗粒的细胞毒. A8 f2 o7 g2 x# S- ~! ^* `  ?7 i# L
副作用，通常通过梯度感染的方法确定所需的病毒用量。以相对细胞数1：1，; d9 U- }+ k! N8 W% @
10：1，100：1，1000：1的病毒颗粒感染靶细胞；加入相对培养液体积1：
: w* F2 ^) A, |4 [3 M: T  [, G$ B7 h1000的Polybrene。在 37度下平板离心30分钟；
& o% N  h- _. i19. 感染 8~12 小时后换液。将含有病毒的培养液小心移入含有消毒液的废液缸
( ~  Y" {8 |' w- c0 ?& y, w0 K中，加入适量全培液。