腺病毒的包装，纯化和感染

名山大川

腺病毒的包装，纯化和感染
8 Z, X* \5 d9 d+ U技术背景：Adeasy系统利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度浓缩等优点，
! d$ J6 L" Q" X4 @) K9 G并破坏了腺病毒基因组中的早期基因E1，使之成为较为安全、高效的病毒载体。- e& w- y4 ?( M
利用带有 E1 基因的 293 细胞作为包装细胞，通过倍比扩增，富集病毒颗粒，并6 i9 ~/ C- E4 ?" i1 _
通过CsCl 梯度离心，透析进行分离纯化。对绝大多数的细胞株可以达到近乎1008 _# N# d! u5 n( v8 Q+ k
％的感染效率。但需要指出的是 Adeasy 同样具有所有病毒载体或转染试剂都不
3 N- u2 I) `4 E4 N5 V$ ^- c: i( I可避免的细胞毒性问题。! B; h" x. P, Q( u3 Q4 |3 {
所需试剂：" `* c2 ?, F. a6 L2 h2 J
? 293细胞；
4 z  p: M4 {% N+ t/ U6 }6 t? 重组好的腺病毒质粒；
+ B' n  V6 K7 |; ]( _8 S? Pac I限制性内切酶；
' |% G& c  ~0 j+ _0 c) v? 质粒回收相关试剂；# l, E1 S2 Z% |) h
? 细胞培养、转染相关试剂；' D  _/ x! I, c" q. Y' J- P
? TBS：10mMTris, 0.9% NaCl,pH8.1;; A2 y: b" v& ~, s2 U* U
? 40%CsCl：28.45gCsCl 溶于42.7ml 的TBS 中，4度保存；" G0 m! L# X" c$ z5 Q# f: W
? 15%CsCl：9.085gCsCl 溶于47.69ml 的TBS 中，4度保存；
( J/ ^$ Z2 P6 A5 O+ o# B, G9 E? Beckman 离心管：14*89 mm，SW41 转头；
( B! I2 b' r: e? Polybrene(sigma)，10 mg/ml；4 z" i- `; m+ s
? 透析袋：Spectrum Co. （成卷供应，带少量甘油，硫化物与重金属），
5 h( J# e( K2 Z# V$ J% \MW=8000~14400；  r1 {# q- W  J' ]% P0 K
? 灭菌甘油。& E& P, ?9 a2 i  A% D5 q
操作流程：
, m0 S$ l" s# D0 u5 S1. 293细胞（E1-transformedhumanembryonickidneycells 在转染前24小时接种
+ [- R7 q5 q% m- W& p, O  a于1或2个60mm 培养盘中，使之在转染时细胞汇合率为50-70%；
, C2 X5 i5 Z$ P0 l6 G) j2. 在转染前，用Pac I处理目的质粒（一般一个60mm 细胞盘需要6μgDNA）。0 y5 }; P8 S, V' j' o, k6 c3 {
处理后质粒用乙醇沉淀并重悬于20μl 无菌水中；) N4 F6 }# t% v/ G
3. 用PEI或其他转染试剂将6μgPac I处理过的质粒转染细胞；6 ]4 L( o; r5 y7 W' Y% Y! i/ Q/ q
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' L4 t: H# z6 x% T4. 8 个小时后移去混合液，加入 4 ml DMEM 完全培养液（10% CBS，1%
- o( l0 p: J9 I  d( sPen/Strep）；  m& Y9 L4 ~( j+ p
5. 在转染后 7 到 10 天用细胞刮（而不是胰酶）将细胞从瓶中刮下并移入 50ml
% E1 z, h6 Q$ W4 M7 [' X5 Q锥形管。离心后将细胞重悬于2.0ml PBS 或全培液中。于液氮中冻结细胞，6 i# w: N* V; K# ~. N  d* p
37℃水浴中溶解，剧烈振荡。此步骤共进行4 次。注意保存时不要反复冻融，# }$ ^. f0 n3 p7 ?7 j1 ^. H0 l
可保存于-20℃；. Y1 d1 N/ O" U
6. 将293细胞以50-70%的汇合率铺于60mm 培养盘中，以30-50%的体积比加
: r- ]& @7 J2 @! f% L  l入含病毒上清液。在感染后2-3天即可看到明显的细胞裂解或CPE现象；: w: y0 b1 J! M. M  @. G$ \* y
7. 在有 1/3 到 1/2 的细胞脱离漂浮时，通常是感染后 3-5 天收集病毒。可进一
- {/ [4 T1 M' b, b* w" J' t) ~9 g步通过Westernblot 或PCR（5μl 病毒上清加上10μl PCR-gradeProteaseK，7 C; h" J, ^& ~, F$ R4 g
55℃消化1小时，然后煮沸样品5min，离心后取1-2μl 进行PCR反应）证
/ Y7 L* K4 \5 C. @0 i' g0 M! F实重组腺病毒的存在；
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. d& |" g' s! w# w8. 按步骤5的方法收集病毒上清。在这种情况下一般至少可收集到10 infectious0 {1 P* i% |4 x8 {
particles/ml 的病毒。每轮的扩增应能提高一个数量级的梯度；& K7 H9 A) ^" U0 U9 x- r
9. 为了进一步扩增，将步骤8获得的病毒上清进一步感染100 mm 培养盘的细
. U  a( c3 c7 `5 b6 G胞，按步骤5的方法收集病毒，并进而将其感染150mm 细胞培养盘中的293. ^4 R# O4 A' j4 N* c/ x
细胞，以获得足够量的病毒；
$ E1 s, Z5 s4 _  d  L/ M7 s0 R8 }10. 将15%CsCl 和40%CsCl 加入Beckman 离心管中制备CsCl 梯度溶液；
) c$ Q9 Y  l# ^% M: Y1 o11. 将最终富集病毒颗粒的病毒上清滴加于CsCl梯度溶液上；
. D, a; Z# R' q- H* Y$ Z! t5 T12. 超速离心，30000rpm，4度离心16个小时；
2 A4 Z8 J% F0 W- ]13. 离心后，应有两条带。位置较高，颜色较弱的条带主要为腺病毒空壳，不具# U! V4 t' N6 z, |
感染能力；位置较低，颜色较亮的条带含有我们需要收集的活病毒颗粒。用
" [2 i: Y7 ^0 @9 T16号针头将这一条带收集；( Z' U3 J  v  A6 Q% ^7 q1 E/ h
14. 在TBS 中透析一小时，随后在含有10％甘油的TBS 中透析两次，每次一小
( Y& t9 z  y6 K, t9 R' R: L时；
* f1 [1 J! g# F' ]0 V5 g  J) f15. 将纯化的腺病毒分装于EP 管中；
. _9 ?( ]/ y: p3 ^! e16. 在Eppendorf Biophotometer中测量透析液中的总蛋白量，1μg病毒蛋白相当
7 ^$ p4 r  G% u2 n0 p于4×109病毒颗粒；
" C9 p5 p' m  K+ W& b17. 长期保存于-70度中，短期可保存于4度，切忌反复冻溶；7 _! e8 U# Y# V! s9 r
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18. 由于腺病毒对不同细胞株的感染效率存在差异，且考虑到病毒颗粒的细胞毒
7 D1 l' T/ s5 D: Y( V8 _副作用，通常通过梯度感染的方法确定所需的病毒用量。以相对细胞数1：1，' O( [2 s# G, O, ?2 ~
10：1，100：1，1000：1的病毒颗粒感染靶细胞；加入相对培养液体积1：
2 L3 r9 E: w2 x& A1000的Polybrene。在 37度下平板离心30分钟；
) b, z. \$ M% _( [5 Q) e3 u$ k% j/ T19. 感染 8~12 小时后换液。将含有病毒的培养液小心移入含有消毒液的废液缸
: L7 {( O9 N& ?- B0 v中，加入适量全培液。