腺病毒的包装，纯化和感染

名山大川

腺病毒的包装，纯化和感染& \1 _5 C" Q4 g
技术背景：Adeasy系统利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度浓缩等优点，2 B3 W, _5 b2 v+ Q+ `7 C8 _: x
并破坏了腺病毒基因组中的早期基因E1，使之成为较为安全、高效的病毒载体。. p* T+ x' O" S; X& X! o# I9 _
利用带有 E1 基因的 293 细胞作为包装细胞，通过倍比扩增，富集病毒颗粒，并4 N3 v! c7 K; L6 i
通过CsCl 梯度离心，透析进行分离纯化。对绝大多数的细胞株可以达到近乎100
) k# c) \: p) x) |- P％的感染效率。但需要指出的是 Adeasy 同样具有所有病毒载体或转染试剂都不
3 _4 T2 K; t5 j+ s- q/ F; g可避免的细胞毒性问题。
1 U4 f: [! @. w1 e8 f所需试剂：: l! x) E% u# T7 {. S1 q
? 293细胞；4 v; G/ A" U) X$ I
? 重组好的腺病毒质粒；
" J" L* a0 b, q' w9 G  i? Pac I限制性内切酶；
; U" w. S: n6 H) P: @' ?# _? 质粒回收相关试剂；
6 A5 t% c7 A( b! }8 Q+ |* S* S? 细胞培养、转染相关试剂；* K1 h5 T3 m1 J  {0 i) c( t
? TBS：10mMTris, 0.9% NaCl,pH8.1;+ \% s- Y9 @7 M. [
? 40%CsCl：28.45gCsCl 溶于42.7ml 的TBS 中，4度保存；3 M! o" Z; ?0 m; u- q# z2 `
? 15%CsCl：9.085gCsCl 溶于47.69ml 的TBS 中，4度保存；
4 J9 C6 y2 z7 w7 R/ E2 U' i? Beckman 离心管：14*89 mm，SW41 转头；
4 S2 }* O) @9 F& R% ^: a2 S* O? Polybrene(sigma)，10 mg/ml；& L' K. X9 u4 p( [' L) e2 J) J+ S- _
? 透析袋：Spectrum Co. （成卷供应，带少量甘油，硫化物与重金属），7 ~4 a6 `7 `- g# T- H, @' l( Y
MW=8000~14400；
& F& e/ j% F* r! ^1 C; o6 N: m? 灭菌甘油。
! O2 D- d7 [6 S+ C' B3 u. {! D- {操作流程：
5 O# A  e$ P( i3 Q2 Y$ F1. 293细胞（E1-transformedhumanembryonickidneycells 在转染前24小时接种
8 s, `3 u$ q! b于1或2个60mm 培养盘中，使之在转染时细胞汇合率为50-70%；
- `, W: T$ T! ~1 i  Q9 U2. 在转染前，用Pac I处理目的质粒（一般一个60mm 细胞盘需要6μgDNA）。
! G- D# e# s( W" }2 {处理后质粒用乙醇沉淀并重悬于20μl 无菌水中；
5 J/ N% L8 F" o! ^3. 用PEI或其他转染试剂将6μgPac I处理过的质粒转染细胞；
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% u4 y2 x+ f4 X" p/ O6 }6 i4 h+ ]$ @( w8 o% e
4. 8 个小时后移去混合液，加入 4 ml DMEM 完全培养液（10% CBS，1%
$ K" E+ N+ K9 z* pPen/Strep）；
. v6 ^4 _$ t$ L$ ?) N5. 在转染后 7 到 10 天用细胞刮（而不是胰酶）将细胞从瓶中刮下并移入 50ml
3 G; }+ ~3 z$ K2 g: I锥形管。离心后将细胞重悬于2.0ml PBS 或全培液中。于液氮中冻结细胞，
" {8 c9 x: S2 Z: K37℃水浴中溶解，剧烈振荡。此步骤共进行4 次。注意保存时不要反复冻融，
" z' b) A6 b8 y: G9 {可保存于-20℃；# `% S: a! S# `+ p
6. 将293细胞以50-70%的汇合率铺于60mm 培养盘中，以30-50%的体积比加1 W! z& e& ~( k# H# y; `
入含病毒上清液。在感染后2-3天即可看到明显的细胞裂解或CPE现象；' V+ l7 d3 ~6 n9 |
7. 在有 1/3 到 1/2 的细胞脱离漂浮时，通常是感染后 3-5 天收集病毒。可进一
) d& s* E" Z  G/ s步通过Westernblot 或PCR（5μl 病毒上清加上10μl PCR-gradeProteaseK，* ^( Q. P* B  v* [
55℃消化1小时，然后煮沸样品5min，离心后取1-2μl 进行PCR反应）证
1 T5 ^3 n6 ^9 M0 m# {3 X4 B实重组腺病毒的存在；( ]/ W& Q  p9 {% _) X. ~% V: j
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8. 按步骤5的方法收集病毒上清。在这种情况下一般至少可收集到10 infectious
( w6 ~* ]5 K- q- o0 s. Sparticles/ml 的病毒。每轮的扩增应能提高一个数量级的梯度；
0 L# Z: J! O8 A; w3 z! m9. 为了进一步扩增，将步骤8获得的病毒上清进一步感染100 mm 培养盘的细# Y# F, O% n# [/ p2 r# H/ }
胞，按步骤5的方法收集病毒，并进而将其感染150mm 细胞培养盘中的293
: J' Y2 Y  \! y7 @9 V6 g  k  g细胞，以获得足够量的病毒；2 n5 T+ S7 D- }& H; Z
10. 将15%CsCl 和40%CsCl 加入Beckman 离心管中制备CsCl 梯度溶液；9 J% K+ P  i$ M; N3 e  E
11. 将最终富集病毒颗粒的病毒上清滴加于CsCl梯度溶液上；
, f& y; J0 ~' `# Z12. 超速离心，30000rpm，4度离心16个小时；
+ p$ J9 I9 _; f: G% B7 g# u. @13. 离心后，应有两条带。位置较高，颜色较弱的条带主要为腺病毒空壳，不具+ H2 ?  i4 Z1 a; l
感染能力；位置较低，颜色较亮的条带含有我们需要收集的活病毒颗粒。用
0 J* o& O6 D$ X# K4 d8 u( k) r16号针头将这一条带收集；% j2 p1 v! s2 S  P% J6 U+ ]3 q% w
14. 在TBS 中透析一小时，随后在含有10％甘油的TBS 中透析两次，每次一小
: D' J& e8 t( I7 x% G0 [时；" L  ]" C8 P# E! j2 V8 i
15. 将纯化的腺病毒分装于EP 管中；0 V0 k  X# J0 j1 r& l( R( L! ~
16. 在Eppendorf Biophotometer中测量透析液中的总蛋白量，1μg病毒蛋白相当+ ~- e7 g7 O# |
于4×109病毒颗粒；$ T3 g/ n+ w  a, S
17. 长期保存于-70度中，短期可保存于4度，切忌反复冻溶；
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# o, J, T  B$ V18. 由于腺病毒对不同细胞株的感染效率存在差异，且考虑到病毒颗粒的细胞毒
8 _- c6 _" w, n9 j" P! ?副作用，通常通过梯度感染的方法确定所需的病毒用量。以相对细胞数1：1，2 Q, Q! u) F$ M. U1 E* K' t
10：1，100：1，1000：1的病毒颗粒感染靶细胞；加入相对培养液体积1：
) N" r2 X  @# U1000的Polybrene。在 37度下平板离心30分钟；# ]# o" i6 x" d; T
19. 感染 8~12 小时后换液。将含有病毒的培养液小心移入含有消毒液的废液缸
/ ^6 X# W  p4 s! C6 v3 B, k中，加入适量全培液。