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[讨论] 细胞爬片过程中的问题汇总 [复制链接]

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包包
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楼主
发表于 2009-5-18 15:23 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
大家在做试验过程中都遇到相似的细胞爬片问题,这是我简单的经验,也是以前在网上的摘抄,希望对大家有帮助& }7 d- U: x7 Y  N
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第一,盖玻片需要过酸,并且自来水、蒸馏水冲洗干净。两张或者以上的玻片很容易因为虹吸作用粘到一起,很容易冲不干净,很容易把两张完全重叠在一起的玻片当成一张,一定要看清楚,晾干片子最好是在消毒饭盒中进行,饭盒底面放上纱布,将玻片斜靠在饭盒侧壁,玻片正面不要接触纱布,否则会粘上毛毛的。然后高压蒸汽灭菌,烤箱中烤干。2 y6 m7 F- w: P) O. h( I! p
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第二,爬片前最好用多聚赖氨酸或者层粘蛋白或者胶原溶液处理玻片,未处理过的细胞不容易贴壁,细胞系还好,原代细胞很少能贴得牢。这一步至关重要,否则在后面用PBS洗片时很容易将细胞洗掉。用这些促进细胞贴壁的溶液处理玻片后,放到培养皿之前需要用培养基冲洗一到三遍!层粘蛋白和胶原还好,多聚赖氨酸有几次我没冲结果细胞全部不贴壁。
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6 k0 l$ x" @, K) J) F: W  b& f& t3 {第三,传代消化下来的细胞一定不要过多稀释,将浓一点的细胞悬液吹打混匀后滴在玻片上,几个小时后再追加培养基。" M: h8 m9 Y! I; n/ V- f- j/ O

8 }& Y! a' t0 o! F# L6 }6 X* k& p0 R第四,玻片在培养皿中容易漂起,如果事先在皿中铺上液体很可能会不容易揭下来,或者揭下来时出印子在镜下很难看。漂起的玻片很容易两面都培养出细胞的,这时背面的细胞必须去除,挺难操作的,用PBS冲洗可能会伤到正面的细胞,用小镊子夹玻片很容易夹碎,也很容易脱落,小心点好。
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; B8 H8 y7 ?; A& o第五,将玻片拿出后一定要记好哪边是正面,最好做玻片时将玻片切成长方形的。目前市场售的多为18mm x 18mm的盖玻片,或者24mmx24mm的盖玻片,正方形,很难分辨反正面,在某个角上打个缺口,对正方形是不中用的。可以用小砂轮切一下改成长方形,至于在某个角上用砂轮做个标记,理论上很简单,实际操作有难度。
3 A% s7 r# g# B8 Y$ `: [( J6 `5 V; Q
; g; Q3 v7 s; q" E( u3 y. ?/ |第六,上面步骤都没问题后,玻片就需要进一步处理了,这里有几个细节,分述如下:, p/ o6 u' l6 }$ I4 V0 }% D
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1.PBS对玻片是冲洗还是浸泡,我个人认为浸泡好,我吃过冲洗的亏,每一步后都要冲洗2-3次,有时还没等试验做完,大部分细胞已经被冲掉了,呵呵!我当时欲哭无泪啊!
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2 S. {3 _# s9 R9 o* }5 }2.4%的多聚甲醛或者别的固定液的温度是多少,有人认为4%26deg;C的好,有人认为37%26deg;C的好,我个人感觉,娇贵的原代细胞先在常温下固定较好,然后放到4%26deg;C冰箱中。我发现直接用4%26deg;C的溶液会造成细胞冷休克,从片上脱落。
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) @8 E# |  c% n: O3.用中性树胶粘盖玻片与载玻片时,尽量少滴树胶,一点点就够了,而且至少半个小时以上才能粘牢,防止在水中脱落。否则盖玻片就会移动,背面会出现树胶的印子,镜下很难看,而且擦不掉的。
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; e7 ]9 d. O; X0 A8 b& A% I1 Y4.固定好的片子放到冰箱中保存,我倒没怎么试过,我基本上做好的就直接做免疫组化。
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9 W; \* m1 a% O0 g" F. ^; m$ ~丁香园网友CancerInsighter补充:. x% d& s- z  y& X# s" U6 Q

7 ^) N! U& C8 A6 D5 P; [, @首先,关于消毒的问题,如果细胞在玻片上的时间不到24小时,个人认为玻片泡酸、清洗就行了,不需要消毒。如果需要细胞在玻片上生长较长一段时间,则泡酸清洗后必须消毒。消毒时我喜欢把玻片放在盛有75%酒精的小烧杯里面,用的时候用镊子小心夹出玻片,在酒精灯上过一下(1秒左右,时间长了玻片会碎裂),玻片上的酒精会被点燃,待酒精烤干就可以用了。效果还是不错的,这种方法我用了半年,只污染过一次(还不一定是玻片的问题),而且每次细胞在玻片上培养的时间一般在7天以上。
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滴加细胞悬液的时候,事先细胞一定要混匀。如果细胞比较多,可以直接往培养皿或孔板内滴加细胞悬液,覆盖玻片,轻柔混匀,注意呈%26ldquo;十%26rdquo;字形摇晃。如果细胞数量少,需要把细胞都滴加在玻片上,则要先从边缘开始,然后再往中央滴,这样有利于细胞均匀分布在玻片上。滴的时候速度要慢,让液体依靠表面张力呈薄层覆盖玻片,要防止细胞悬液溢出玻片。这样一般2-4小时后细胞就贴壁了,这时候再补足的培养基,覆盖波片。- u& S& V: T) i+ W, G- g
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玻片的正反面。这个没注意有可能前功尽弃。关键是取、放玻片的时候要全神贯注,不能搞反了。采用其他的方法可能更麻烦,不如自己小心点。另外取玻片的时候,由于玻片比较薄,可以用1毫升的胰岛素注射针自制一个钩子,把针头折弯就可以了,这样取玻片的时候比较方便。
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染色滴加抗体时,为了节省抗体,可以先把抗体滴加在干净的载波片上,然后玻片的细胞面朝向抗体倒扣,同时注意防止气泡 和玻片的正反。一般24毫米的玻片只需要30-50微升抗体。当然如果操作不熟练,抗体又足够,那就直接在玻片的细胞面上加抗体吧 。
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玻片上细胞的漂洗。我从来不冲洗,只用PBS浸泡,泡了就倒掉,半分钟都不到,时间的长短个人感觉影响不大,能把残留的抗体洗掉就行了。7 O7 `* s: O/ {9 r3 o$ l# @
* k6 A3 D. v! T: @0 H! t
细胞爬片固定好以后,如果要保存,我们的做法是倒掉固定液,PBS漂洗后干片保存在4度,最长半年没问题。当然可能不同抗原的保存效果不一样。

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沙发
发表于 2009-6-9 09:04 |只看该作者
好,顶!!!!

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优秀会员 金话筒

藤椅
发表于 2009-6-10 08:26 |只看该作者
不错!~

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板凳
发表于 2010-1-7 16:15 |只看该作者
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金话筒 优秀会员

报纸
发表于 2010-1-17 09:48 |只看该作者
总结挺好的,用过在酒精灯上烤,效果很好
3 x7 M+ F, B2 g6 ^首先,关于消毒的问题,如果细胞在玻片上的时间不到24小时,个人认为玻片泡酸、清洗就行了,不需要消毒。如果需要细胞在玻片上生长较长一段时间,则泡酸清洗后必须消毒。消毒时我喜欢把玻片放在盛有75%酒精的小烧杯里面,用的时候用镊子小心夹出玻片,在酒精灯上过一下(1秒左右,时间长了玻片会碎裂),玻片上的酒精会被点燃,待酒精烤干就可以用了。效果还是不错的,这种方法我用了半年,只污染过一次(还不一定是玻片的问题),而且每次细胞在玻片上培养的时间一般在7天以上。7 h-

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地板
发表于 2010-1-22 10:02 |只看该作者
不错!

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发表于 2010-2-3 22:28 |只看该作者
xiexieliao

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发表于 2010-2-10 19:44 |只看该作者

% v9 o6 F% P! V1 v  }5 I5 ~谢谢

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发表于 2010-3-2 19:43 |只看该作者
真的是好帖,讲的很详细,太感谢了

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发表于 2010-3-5 23:51 |只看该作者
不错
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