再次求助，MSC的P2代就出现问题，有图

城墨

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抱歉又来版里提问题了，不知道是第几次了，总是会有一群好心人分享自己的知识，让我很感动。
5 W3 P6 ?, y/ a' o1 [! q这次依旧是关于大鼠MSC的形态学照片，之前的一个帖子在这。http://www.stemcell8.cn/thread-120589-1-1.html
7 n! i7 u6 x9 e$ L  k' S这次提取的时候出现了一个问题，就是细胞形态让我觉得很差。
+ z7 O5 W6 B9 J& [有四个编号，分别是1—4，细胞均是P2代。同个编号都是同一皿里细胞，只是拍摄倍数不同。3 Z. H, a, `) Z1 N6 B+ S  l0 f
个人认为，除了4状态好点外，3一般，1和2都不行，不知道我的感觉正确不正确。
- j. _6 A! d; V4 k' }6 `+ {也不知道哪里出了问题，上次的细胞呼呼的长，我一传三，两天就长满了，让另一个做干细胞师兄很惊讶。
8 ?0 P1 u( h% R# i8 Q" e: U培养基为低糖的DMEM，加10%的GIBCO血清，加双抗，未加bFGF等因子。这是我用的配方。3 R. m& h; @6 N! W/ _0 k
希望再次获得帮助，很感激这里的人。求指点。

城墨

回复 Albertchen 的帖子
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2 P, X, d& F2 ~- I+ o我觉得没必要纠结我有没有必要洗两遍的问题。第一遍的胰酶是中和血清的，几乎没有消化能力，就当我是过了一遍PBS吧。8 w7 S4 g" J# s8 }
过两遍胰酶或者三遍胰酶，只是为了让细胞消化好，我现在已经摸索出来了MSC消化成单细胞的条件了。
% g& b( o% M6 x7 v, Q# ]% u% I已经做了流式，两阴两阳，符合2%以下和95%以上的要求。
' n+ f; S5 o4 x8 l: e现在做分化，私以为做不出分化的干细胞，前期都是胡扯。
. a0 b7 U/ n7 w- c7楼确实棒，对当时的我确实是“当头棒喝”的作用。我很感激他。
6 x: O3 U4 N) q另外最近关注了一篇论文，发现MSC和fibroblast在流式上也是惊人相似的。) w, S6 n3 C  L# [% V
所以MSC的三个条件中，分化能力可能是最重要的。

Albertchen

完全没有必要用胰酶洗两遍啊，这样只会让细胞状态变差，还有你不做流式，怎么判断你的细胞是msc还是成纤维细胞呢？7楼的解释太棒了，哈哈

城墨

回复 晗晗 的帖子% F. f: k( H3 L9 m. e
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是吸掉废液后加胰酶，第一次加入胰酶其实只是充当PBS冲洗的左右，和残留的血清中和，起不了消化的效果，吸去第一次的胰酶后面再加入胰酶才是消化的开始。
  B5 M# ?3 F: f: e) l" L$ x消化5分钟之久会不会有些过头了。
2 X+ D4 O  e) x5 ?我之所以说出我的这种方法，不是因为这种方法有何不妥，因为其余的细胞我都这么做的，消化非常好。而是因为我知道MSC对消化时间和程度比较敏感而已。
2 h% ]1 i8 G; k; j我目前采用的方法是0.125%的胰酶过三遍，放入37度培养箱中，2到3分钟后再吹打细胞至单悬液，没有什么问题。

晗晗

看起来有老化的现象，关我觉得是消化的问题，我们是从来不这样做，我以为，消化应该是弃掉废液，用合适的PBS轻轻洗涤，之后去除，然后加足量胰酶，0.125-0.25%都可以，让胰酶轻轻覆盖全部细胞，室温停留1-2分钟后吸去，之后瓶子放培养箱3-5分钟，还有你怎么可以不吸掉废液然后用PBS洗一洗而是用胰酶直接就算洗了，真是第一次听说

Dunncao

我就想问，现在做出来了吗

echizne

死细胞有点多，是否消化过度呢？

城墨

回复 woshibotao_01 的帖子/ K1 [. e6 m! ~! q

2 w, r, e' n% R0 Q- V& P0 z$ V; S非常感谢您的回复。我的培养基是粉末自己配的。里面还有L-甘氨酰胺成分。现已购买invitrogen的GlutaMAX。

woshibotao_01

之前遇到过类似的问题，看着是MSC未贴壁展开，后来发现是培养基营养不足2 ?6 Z+ F- J! [- ^3 D' E' o
可能是4度放置超过一星期或者是长时间未换液，建议换新鲜液，可以补加谷氨酰胺

jinhaifeng

培养基里未加谷氨酰胺，导致细胞生长聚堆