细胞培养基的基本要求、组成和作用相关问题汇总

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细胞培养基的基本要求4 I& Y( |0 @* @$ w  y6 d7 M

, w* g+ R# n( _5 j' \* s/ }6 p3 J7 w1、营养成分：氨基酸、单糖、维生素、无机离子与微量元素。0 K# i' O7 I# r% R2 {9 m/ K

6 M0 @- e* w$ q2、促生长因子及激素
' W) [2 [( a: h, M& p
% Z* m8 P& a4 q3、渗透压
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( o7 J. C/ s7 R2 b4、pH
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0 M1 v+ A0 O3 P$ |5、无毒、无污染
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& E8 R, J: D/ b% O- r1 I细胞培养基组成及作用
0 L; a5 M5 K% F) d* P, R3 v
4 M' K+ E0 V5 ]. W1 C! D4 B8 M& ^2 ~1、氨基酸
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2 C8 n, I, H/ d7 d/ J4 Y组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。
5 ]  O  s4 _& k4 Z必需氨基酸包括L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸等。 . J( D4 D0 ]/ ?8 ]0 b

, ?+ W8 B7 p8 a' ^! p( R1 R2、维生素
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" d2 h" }* b7 \5 c1 l/ b; N0 d4 i维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用。在细胞培养中，尽管血清是维生素重要来源， 但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长。
" e* x; M* [( a, k, s脂溶性维生素如：A、D、E、K。 8 U! r% @3 v7 P) X1 c- }  W
水溶性维生素如：B1、B2、B6、B12、泛酸、叶酸、生物素、C、烟酰胺等。
; L; x7 r( `& U4 Q0 }许多维生素参与构成各种酶的活性基团的成分，没有它们，酶便没有活性，代谢活动将无法进行。   w5 G; q) s5 D  K6 Y- G! s9 Z9 ]
VA是细胞合成糖蛋白时寡糖基的载体，对上皮细胞有重要的维护作用。VD参与调节钙的吸收。VE是抗氧剂，可防止组成生物膜的磷脂中不饱和脂肪酸被氧化。VK缺乏会引起低凝血酶原及凝血时间延长。 $ x  X6 G2 _* f
叶酸是合成四氢叶酸的重要原料，四氢叶酸在核酸的生物合成和蛋白质的生物合成过程中起重要作用。
0 `& O, J2 c. c' o; {生物素是一些特异羧化酶的组成部分，参与糖代谢和脂肪酸的合成过程。
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3、碳水化合物 : Y& K# g/ m; u
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碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。
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: k* B+ w3 g4 {- `4、无机离子 3 A0 R9 z% [8 `

; Y! V0 m9 f- z) }% z钠、钾、镁、钙、磷等基本的无机离子，这些都是细胞组成所必须并参与细胞的代谢。培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg %26minus;320 mOsm/kg。标准培养液的渗透压在此范围内波动。特别注意：向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质。
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Na+是细胞外液中最主要的阳离子，对维持渗透压的恒定有决定性的作用。K+主要分布在细胞内液，细胞内K +的对于激活某些酶是必需的，它在调节细胞内环境的酸碱平衡也有极重要意义。 Ca2+ 在细胞外液中的作用是将组织内部细胞之间相互粘着，在细胞内参与许多重要的细胞生理活动，如传导、参与肌肉细胞收缩等。 Mg2+ 是构成细胞间质的重要成分，对于细胞间相互稳定结合有很重要的意义。磷的化合物对细胞物质代谢和生理功能调控的功用是十分广泛而不可缺少。

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细胞培养的用途包括：" |! x- O% x; s- e

  M* M2 I4 l3 g$ J1、科学研究：药物研究开发与基础研究
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! `' s; I. G& U% Y. {6 f* |$ d药物研究与开发
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5 k6 R: h& R1 E& D（1）新药筛选：如化学合成药物药效研究、中药有效成分筛选与鉴定等。 ! m9 L/ n! E4 k

9 g+ z- h8 X% A/ k: C# M; \* s（2）疫苗研究与开发：如病毒性疫苗的研究与开发（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。 ( x% \1 {3 e2 c1 ^' r4 @! M" \
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（3）基因工程药物研究与开发：如干扰素研究与开发，细胞生长因子研究与开发等。
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9 ^8 E7 _1 r1 g  u（4）细胞工程药物研究与开发：生物活性多肽研究与开发，人参皂甙、紫杉醇等生物活性成分研究与开发。
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（5）单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体，治疗用单克隆抗体。
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! k8 [4 r. u$ D% v8 \基础研究
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（1）药物作用机理
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（2）基因功能 5 m, T8 H1 d7 {! d0 X
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（3）疾病发生机理
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" P# K/ \  y5 p. S: h2、生物制药 ! q. v$ j9 K! ]4 I
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（1）疫苗生产：如病毒性疫苗（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。 + _5 y, K  {% h, Z3 e. A

) r+ V8 U9 q9 s) J" v) b（2）基因工程药物生产：如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素、粒细胞生长因子、胸腺肽等。
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1 k3 [  {( S) g# {! V* O（3）诊断用和药用单克隆抗体生产。* A) y& l  J( p2 S/ w

: q& j/ @6 R: K: n（4）细胞工程药物生产：生物细胞内的一些生物活性多肽，生物活性物质等。

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一、细胞培养基本概念
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细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。 细胞培养 的培养物为单个细胞或细胞群。
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) Q' b/ @% y. Z7 d! }& N# L6 W  T在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤或纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。外周血淋巴 细胞培养 具有时间短、技术简便、可重复取材等优点，它在临床染色体分析中使用最广泛。体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无取制的传代和生长。永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特征。但细胞 克隆 的细胞系其这一特征可以不明显。
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7 a! d# J! ^, D& H2 j$ i" t" }二、细胞培养的环境
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细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。/ i" }/ j/ W- {- t9 _# d
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1、无污染环境8 f. b8 K0 u- \; ?$ p
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培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。  K  o( F+ c) K2 O9 Z3 S; u

$ Y4 }2 B8 ]' l; ^! z2 c2、恒定的温度  q- N- q# Q+ j" y0 v% L. R
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维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体 细胞培养 的标准温度为36.5℃%26plusmn;0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。
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1 \  {& e! B* P+ L) }- I3 x3、气体环境
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/ J- }8 v( [! N" H, _: Z0 K  l气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。
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二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的PH值。大多数细胞的适宜PH为7.2-7.4，偏离这一范围对 细胞培养 将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。有资料显示，原代羊水 细胞培养 PH6.8时最适。
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+ x( b- f3 f& k- ^细胞培养 液PH浓度的调节最常用的为加NaHCO3的方法，因为NaHCO3可供CO2，但二氧易于逸出，故最适用于封闭培养，而羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）因其对细胞无毒性，也起缓冲作用，有防止PH迅速变动的特性而用于开放 细胞培养 技术中，其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的PH值。! c( D( ]  {! _) x9 F4 h
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4、细胞培养基
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培养是既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类；按其来源分为合成培养基和天然培养基。. |" ?; ~1 t$ O4 O+ V9 _+ c: I
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（1）合成培养基：合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量无素和细胞生长因子等。单独使用细胞虽有生存但不能很好的生长增殖。
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) Y2 Y) ~$ d4 c- f（2）天然培养基：使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合志培养基合用，能使细胞硕利增殖生长。常见使用最为5-20%。

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细胞培养基发展趋势
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1．无血清培养基：是设计用来在无血清条件下促使特殊类型的细胞生长或进行专门应用的培养基。需要添加生长因子和/或细胞因子，含有个别蛋白或大量蛋白组分。其主要优点：增加确定性；性能更一致；容易进行纯化和下游加工；提高制品安全性和/或产量。 & b# [, a2 F/ {: e7 E+ E
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2．无蛋白培养基：培养基中没有添加蛋白，但仍然可能包含一些动物或植物来源的成分（如低分子量肽的各种水解物）。 * e9 d% M$ x- U5 {9 l

3 d  W0 g( A8 o% p' x" C; G3．化学限定培养基：培养基中不包含有蛋白、水解产物或未知结构的组分，所有的成分均有已知的化学结构 ; C, Z8 ?1 X4 \& j# |6 @1 u

* U" n7 B& ^8 e2 a5 j培养基的品质
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1．外观：颜色、粉末细度须均匀。 7 }; f* r- ?/ v6 {

  \7 z! q+ s* g2．溶解性：培养基完全溶解，可以避免培养基内营养成分的流失。
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& N' C- {% b) P3．pH值：哺乳类动物细胞生长需要合适的酸碱度，同时pH值的测定也可以检查培养基的批间差异。 1 U( \2 U9 G' G% w
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4．水分：培养基的营养成份很丰富，利于微生物的滋长，因此水分的含量控制可以延长有效期。
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3 v' {- \! ^" _; ~5．冰点渗透压：细胞必须生活在合适的渗透压环境中；同时渗透压值的测定也可以检查培养基的批间差异。 ! i8 C* J8 v. j) b7 i" H8 m6 ~6 Q

* v6 Y! A' ?* d, X% v/ _6．菌落总数：粉末培养基不是无菌制剂，培养基本身的营养成分很丰富，容易滋生微生物，因此菌落的控制可以延长有效期
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# a3 }  _# z! ~/ G& g7．细胞生长试验：可检查细胞培养基是否有促生长的能力，以及是否有不利细胞生长的毒素。 2 o0 T- p$ R; S% a5 D
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8．细菌内毒素：为满足生物制品细菌内毒素的控制要求，作为生物制品生产原料的培养基同样需要细菌内毒素控制。
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9．稳定性：确定产品的储存、运输条件，产品的保质期限。 7 _; `5 `% }. g- H

7 e$ G9 @4 C* V( z! E, r" v/ T10．一致性：验证产品的均一性。

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无血清技术及其培养基3 Q' f* z  z: g& W2 Z' H

' H" ?2 l9 q% T) v" o4 I+ [. g! V, J经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基和无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可降低生产成本，简化分离纯化步骤，避免病毒污染造成的危害。
' `, b2 B! Q7 x! v+ a4 H
; s3 W" M5 L6 X4 z  h7 u9 F! G无血清培养基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合，如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。因此研制出无血清培养基一直是生物科学工作者努力的目标。上海恒利安生物科技有限公司已成功开发了商业化的多种无血清培养基，可满足众多厂商的需求。
& I8 m2 H* s7 ?2 z2 i, W
5 w: G5 j" p, i0 P0 o7 r一、无血清培养基的基本配方:基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。
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用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长；而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。
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添加组分包括以下几大类物质：4 W. Y3 c4 A* t

+ j7 X) d; T# O: }9 A6 f7 N! ~（1）促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。
+ ?' v* N2 q: b. _: \1 V0 }7 J( D（2）促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。
+ L9 y0 {$ Z! ?3 E5 [6 Z（3）酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制剂。
- |8 E& H) A3 a4 ]8 y! z（4）结合蛋白和转运蛋白：常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。 8 S$ L6 Z' U; m' I! z, M
（5）微量元素：硒是最常见的。

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细胞培养基的定义1 O/ I% s! p' f- Z; K# j

- S& s/ [& \, q' g6 e人工模拟细胞体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质,它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。/ @* ~% v3 Z8 v

% M. C5 p* v8 M- P+ _( r包括： 3 @; y8 i' D( }3 C) W$ n$ ^
5 S! \$ v; Z# U" ^  c
1．天然培养基 指来自动物体液或利用组织分离提取的一些培养基，如动物血浆、胚胎浸出液、血清和人血清，水解乳蛋白等。
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2．合成培养基 人工设计、配制的培养基，如MEM、199、DMEM、RPMI1640等。