小鼠胚胎干细胞培养实验步骤（经验分享）

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小鼠胚胎干细胞培养实验步骤（经验分享）6 y' b8 ], E; w. q* u- p# M8 |6 C
以下是根据NIH老年病研究所提供的英文的R1胚胎干细胞培养protocol整理而成。根据经验作部分修改。
  F% L# S  W8 p* _+ T
: R7 W6 i$ {) x- l9 @' p1、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态. z/ ^& I' t' k
培养基/ X1 k4 U; }5 e9 B- Y
细胞复苏6 @6 d. j$ _. T
冻存细胞0 f$ l* g. F# e9 |' R
明胶包被  B: {5 F! y+ j/ M, M" e8 V  z7 T
细胞传代/ F4 A2 J8 Z8 H2 G
* V0 n2 i5 M" g- @
2 、体外分化# G9 [$ O9 C( F/ |& }* {& ^
培养基
& \# r+ ?9 t! U4 W$ c+ y+ y包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）, I6 G" |4 S, H5 A9 w
体外分化方法
" Z: F/ T) E' W' o4 ]; P! m$ X3 W9 K' H0 p) s- h* I. S
注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。
! O7 K% Q8 ?0 ?# y( Q
; v' ]; S/ k* ?4 b5 Q+ b& l1 [: ^一般培养--维持ES细胞处于未分化状态# u1 O4 W) z8 d, h# Q
ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
/ i2 f" s% A. `7 k$ |3 [
' Q' u5 Y, O# r8 p* \培养基" ]9 m3 V( B! d. K. ^5 \
ES:
9 w( b0 E( _1 D( \配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。
5 W  V' T& o: B7 \+ l$ V7 v
( L8 J8 Z4 y0 e- {5 N" D) q3 m4 A贮存液
: y9 j" i7 S; `( @6 k/ p7 ^% ^% cDMEM(高糖)
# G3 S$ `2 m% j6 ^( \# e5 q; h9 `马血清（HS） ( l/ ^) x% f; F& Z
L-谷氨酰胺（200mM） : p3 x9 M; F& c! l& w7 H& @
MEM NEAA（10mM） ) ^" [4 o2 N- @$ C) t1 @
HEPES（1M） 8 h% L6 J5 p+ Y' g1 G" O
β-巯基乙醇（55Mm）
3 I+ X  R6 }' r' HPEST
, l% X) ]) ~( t* H% CLIF % L9 A+ M) q% a( a! c

- {$ _  g7 }: s' ~3 P$ e复苏细胞
* B( c9 U  k% h; u细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。1 n4 [) C8 t& A7 e# I- Y% i# q
5 r4 ^2 H3 v/ U8 q& m
步骤：* \6 Q+ Y& K1 L! F6 f
1．从液氮中取出一管细胞；
* {1 u/ |" x8 z" T2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；1 S6 T6 {. V4 t
3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；  e7 g) h6 k4 n* ^
4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；- d% S. v; ?6 f' d7 \1 w  {" t
5．离心3分钟；
- q# W, X- {7 e3 X4 L6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；
4 [0 |* f- z- o7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；
1 g2 U$ T. b' g& z* n+ N1 b$ X4 z8 o8．孵育。
9 m, a4 v$ M5 @* {+ U
$ ?0 Q* `6 z6 d7 g+ \冻存细胞
  C, S/ _, l) e, l. _冻存液
+ r6 \: k, e1 N/ y3 ~4 w2 O8 `90％HS和10％DMSO( U- h  [. l3 Q$ _) _

( F5 B, Q! |; u/ X' O步骤：. S# o8 X: E! a& r  j$ o
1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；
5 E4 \! R/ y: ]4 s. B, q' b- l2．用细胞刮刀收集细胞；( @/ o- ~# z2 E' g( G
3．将细胞转入15ml 离心管管内并离心3分钟；, T0 ~( y7 C3 g, s, ~1 X% H
4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10 cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）
7 E: G2 P0 B) ~1 K# V5．分装于冻存管内，每管1ml；& ]9 z( f1 v4 B! M  k( ?% A
6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。5 |5 ~) N* M1 N. P8 C) D; {+ j) s
7 u) I+ [2 j+ b( Q. @3 `
Geltin（明胶）包被
$ y; v7 K1 y* L  _7 q准备500ml 0.1％geltin溶液
/ R" b* v, y: v- Y( n  A1．将0.5 g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。
& w) R  W8 K/ E& N/ z& D  g- V9 X, g- d2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.22 μm滤膜过滤，贮存在4℃。. c* O! n4 I9 c1 V$ `, I
包被培养板或培养皿1 K( H9 G* ]0 ]4 U" t' `
1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15 cm培养皿加2ml，10 cm培养皿加0.5～1 ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。）；
8 b, c2 `. H1 G3 k7 _2．置室温30分钟；$ P; l! b8 m% k$ _9 n; v$ s
3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平放或倒扣，以免明胶污染盖子和流出培养板。
' u/ m$ o9 o# T
% v/ v( p: ]* A) u* V9 B5 X( \! P: S细胞传代/ h  ?9 J! j6 B5 v" h, d
建议每2天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法中。
# h. }2 I. ]7 T& u/ r1 o: W6 d
8 _% |; r0 @; d9 A; G3 O1．去除培养液；# D( B$ N& O2 B5 ]6 {) X! n  y) w
2．无钙镁PBS（Gibco）洗涤；
" L$ q) |  F; N8 c8 O3．加入胰酶EDTA（Gibco）。37℃孵育5分钟。6 Y7 k) A$ b+ {5 l
4．加入ES培养基使胰酶失活；
% X& Q+ f. k9 o% l& H" T$ _: e+ ?( |5．将细胞转入15 ml离心管中离心3min；
$ X* L. R! P( x3 u# E( H* T6．去除上清，将细胞重悬于2 ml ES培养基，至少吹打10－20次。) \; H  W- A+ ^
如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少细胞的自然分化。
4 ~2 _% B' Q, v3 w$ g* U7．将细胞接种在没有包被的组织培养皿中（使用和一开始同样规格的培养皿）放入温箱2小时（分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将保持悬浮）；  q) t' U9 N2 Z2 h4 m
8．将含有细胞的培养基转入geltin包被的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开（前面已经提到--ES细胞有聚集成团的倾向）' b1 X' j* J5 f5 y. R% l" z4 i, I- A
9．建议按1：4－1：10的比率传代 (ATCC), N3 ]- j3 F2 m0 t7 z
保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8的比率是好的，可以使细胞的自然分化降到最低。当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表1来计算传代比率。; C+ f( `/ @! T. `
5 ~2 y& B' o  D& S4 X: E
体外分化
& ]' e5 M) l6 Y! X6 q胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。- R! x- V' D- F& @" ~
时间线（总时间为27～34天）
3 H7 D8 L% `% E/ q. n第2步；4＋1天 第3步；4－10天 第4步；4天 第5步；10－15天 * n# F. a  [2 z
" B% J9 m/ L& ]$ x, w
体外向心肌细胞方向分化
) {# E, \+ n. Y4 v2 q: _, t6 h胚胎干细胞在体外去除LIF情况下会自然向心肌细胞方向分化，小鼠的R1系一般在第7-8天自然出现搏动的心肌细胞，与胚胎发育时间线是完全一致的。
6 u  Z" P2 @6 f# ~: p( o
! B' w% A$ ^% e! S- v培养基
. y/ |8 k. {- k# |3 k- GEB7 E! R- _7 Y6 q/ v  V
配制一20×不含DMEM，FBS，LIF的溶液（该溶液也能用于ES培养基--见前述）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。将21ml该溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。
3 p# _# ]" Q) s) M贮存液 - ~$ ^) W) V$ E
DMEM(高糖) ' u! u' u" D2 L6 |# O
胎牛血清
3 ?; V$ z' J6 w( \L-谷氨酰胺（200mM）
8 b8 R2 e2 J1 |( G) k- n4 uMEM NEAA（10mM） 0 Y) @9 {( A0 T7 ~
HEPES（1M） : \7 z& \$ B) q& d! e- Y
β-巯基乙醇（55Mm）
+ x3 O/ g, ^. r+ vPEST（P104U/mlS104μg/ml ! s8 a8 c8 ?+ }( i

. ]4 v5 e& X1 A- L4 k* _# cITSFn and N3（分化培养基）：
) K5 X  R5 K* ~) \配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分装在15ml 离心管中，（稀释为1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml），0.2μm滤膜过滤，贮存在-20℃。将该溶液加入DMEM/F12中制备培养基，贮存于4℃。
6 J$ ~) W7 i/ e  o4 R0 [4 U贮存液 & `1 m+ b) h/ J& j- M  @
DMEM(高糖) ! y4 [$ ?9 ]% F( q5 ~
转铁蛋白50mg/ml * t) u8 x0 W& s$ w1 \
胰岛素5mg/ml
* D# u( ?# R0 h4 N4 c. ^亚硒酸钠300μM " L1 l- u! i) W6 F* s- W. b& a; y
黄体酮（20μM）
  n! {1 y2 a8 J9 ]1 ]: D腐胺（100μM）
" Y) y8 H+ K( p; }PEST（P104U/ml S104μg/ml）
  q9 @6 L9 {) I% y& X层粘连蛋白100μg/ml
) B' q8 |2 f: V* s* l/ B* d" I  k纤维连接蛋白250μg/ml . |9 ?+ E% Z; y! N7 a7 @" W/ h" l
碱性rhFGF, 10μg/ml 5 G4 b5 O9 ~1 o/ I
*在第4步将bFGF加入N3培养基使终浓度为10ng/ml。" ?+ P# e4 h+ }2 h1 Z
4 F# ]  J* P5 N& I8 n- ^$ l( R8 d7 G
ITSFn and N3培养基贮存液的准备
5 z: ]8 N, _. W. F使用无菌的溶剂和稀释液，在分装之前要对溶液进行过滤，如果因为某些原因溶液在分装之前没有进行过滤，需要在管子上标明以便别人在使用时知道该溶液不能直接用于细胞培养。0 b) n( [$ m$ z
贮存液 溶剂，贮存液，稀释剂和储存
# W# b" m( X/ Q8 M) V转铁蛋白50mg/ml
( j+ v: ?- I, n* q1 v8 J' g胰岛素5mg/ml
0 F* A; j* ?; {' _亚硒酸钠300μM # g2 x# j1 _& {$ h4 s0 H! m5 ]
黄体酮（20μM）
' |- j8 }+ _; i# t6 F腐胺（100μM）
1 y2 E/ `! r% Q4 ^; m" KPEST（P104U/ml S104μg/ml）
# X# d: o/ D8 M1 x: E5 ^层粘连蛋白（100μg/ml）
, V2 c- P2 j5 B% Z5 ~5 f0 m纤维连接蛋白（250μg/ml ） : a  X1 K/ W* k$ R8 j. G
碱性rhFGF, （10μg/ml） ' v% c; p7 X. N. F/ q

* \2 U* F) u1 @' E包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）2 k# f5 O: l% _3 p* W! V% Q. K6 [+ H

% b/ P  R' w5 K/ |包被液的准备5 B& J+ A2 V2 B
多聚-L-赖氨酸，15μg/ml2 l, \% |$ E/ ]1 D1 x% e$ ^2 z; M
把75ml多聚-L-赖氨酸和425ml 1×PBS混合。贮存在4℃。3 _2 l" S0 U- j  }* @& g# ^
纤维结合蛋白，1μg/ml & ]0 s( l. b; q- J3 V8 }9 u+ ^% v
把0.5ml纤维结合蛋白和500ml 1×PBS混合。# R& P  {6 q3 c
6 A- g8 j/ j1 ~
包被过程：  A) A/ e0 w; q' G2 `$ c+ ^
1．加入多聚-L-赖氨酸，至少2－3小时（过夜也行）& ]5 ~, \' S; K4 e3 d: Y
2．吸出多聚-L-赖氨酸9 c' w7 e: Y/ `/ G6 D4 D
3．加入纤维结合蛋白，大约1－2小时8 B0 D+ R2 V% Y
4．吸出纤维结合蛋白，放置30分钟晾干8 A! r) v/ {0 t
5．贮存在4℃4 M1 Q* k, i( y: o
24孔板用200μl，6孔板用500μl。震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻片或培养孔。有时需要剧烈震荡培养板。+ W2 Y- k' j) I

5 X! S3 m, T8 L+ e4 H体外分化方法; a1 P, U8 ~; M' C
3 R  S4 k% q- g( U" P. `( W
第1步：ES培养基
; y' p* p$ ]2 h) ^) w) A4 [/ o( [在LIF存在的条件下维持细胞培养
  Z# M5 F2 e- Y! o* S; n# k3 H
9 q3 u8 D% ?- a& ~; r3 A7 Y第2步：EB培养基
7 r& c+ [, f  p/ Y使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
& ^* d3 K9 Y; a  k  k1．分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）( k6 }0 {" a3 \' ^
2．纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15ml管中离心3分钟。& j% |% u3 d$ {8 j3 X3 P) s- N
3．用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液& w6 d+ e. {1 x. \- W9 S
4．一个15cm的细菌培养皿接种4～5×106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。
: a3 [1 o/ u" j- a' H5．2天后更换培养基
0 d( C( ], P& a, V8 |) S' J将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
2 u& d& V/ e2 V' n6．用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
+ I# b# M9 O: U# J) I5 ]4 q形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。
. Z+ [% q: h& s& S
. N- O% c! r0 |第3步--ITSFn培养基: j6 a1 b: P7 `9 L
在最少量培养基中选择神经前体细胞1 F( i- A3 L3 E! f) i" d2 N
1．在胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基
0 w! ?% O; }0 a! ?7 h2．并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。' e. l; S3 F, f# {: X/ }% z" Q
3．保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。
* x$ v3 X1 l$ x( g) s观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个清晰的标志几天以后，通常是在第3步的第6到第10天。
1 g: D4 u% `$ u/ I+ R0 A! t# Y4 x) V& |
第4步－N3培养基＋bFGF
4 l4 F  |/ \" a通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。7 [* l/ P4 }5 Q' E
1.PBS洗涤，加入1-2ml 胰酶
/ I" \. T! V) V% q) N! D8 ^, X2．37℃孵育5分钟
% Z/ K+ }' \' m/ O" \9 y( B3．用4mlEB培养基终止胰酶活性，将细胞转入锥形管中放置3～5分钟移出细胞团，将上清移入一新的离心管离心。9 v. _8 z2 z  y4 ]2 j& j
4．将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。# P- `7 I6 y7 r+ V0 e: `
5．将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上（最好将盖玻片放于24孔培养板或6孔培养板，6孔培养板中每孔放置5个盖玻片如果是塑料的放置4个，以使最大可能的获得样品数量）。24孔板接种3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。7 ^" T/ S3 y) t
6．2天后更换培养基
! F9 S' Z  R3 k6 O2 K/ }$ I* w. {+ U, y; v3 C
第5步－N3培养基
- W; z, j( Z  Y8 U6 p* F+ [通过撤除bFGF使神经前体细胞分化6 Q: x7 c$ q$ _9 o
1．细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基
! R0 S  I6 M8 g% w7 P2．根据需要换液（大约每隔一天）
. `8 _7 T6 l2 ]* v! _+ T  g3．分化10～15天后固定细胞
* Z) Q! ?& t9 _. }) i! v. Q移除培养基( i3 N$ J" j9 s( l
PBS洗涤
' g/ u# O& V. ^# i" _: {. z# `加入4%福尔马林0 E/ P& S9 E" g3 b* n9 f
室温放置30分钟
$ @( u: F! S/ b; D4 ^% b, EPBS洗涤2次
5 }- k4 j& P1 a7 k  H储存于PBS。长期储存使用含0.01％叠氮化纳的PBS% i  D9 ?  k1 K  ]1 ~# o/ {9 U& f
移植细胞的准备8 f9 p$ b5 g' X  a
细胞在胚状体形成4天以后被移植（相应于体外分化过程中的第2步末细胞被转种到组织培养板）。正如在前文体外分化中所描述的在移植之前4天开始形成胚状体。通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10cm的培养皿。
' k+ N: O! ]2 n3 f& y- V2 v9 ^6 V; f& S  V# ], Q2 c- O( t
移植
* t/ }, f3 C2 `$ O' K0 l3 a' s1．将胚状体转移至一15ml 圆锥形管中放置3～5分钟使胚状体沉降下来。# Y0 c- T5 G" R  Y; s
细胞被离心3分钟会更好。放置使之沉降将会去除更多的单个细胞（包括死细胞）而这些细胞可以被离心下来。
3 @3 O% g+ f* J+ D2．去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1×PBS中
! E+ f/ {6 i1 L  D1 Q8 @3．离心3分钟
0 F! t1 ^& W7 r4．去除上清加入1×胰酶（10cm的培养皿加1ml）
/ I) k6 X* Z8 I: w! p5．37℃水浴5分钟& g6 O6 S0 ?7 F4 h; Q
6．加入5mlEB培养基小心吹打约10次& E# o6 W9 |& a
小心处理细胞很重要，进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。
! P& z: s+ N. m& x7．离心2分钟
9 [3 a& a8 ], c: j3 ]" `( M/ c8．吸出上清将细胞重悬于500μl EB培养基* ]; c2 u, X9 |
9．用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次
3 [' z! {5 W4 g3 L: T/ T( f10．离心2次
  m8 O" C, V. S+ d# |: h4 Q11．吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基  _4 L% \& ?% n6 N" k' f$ _( T

- E4 `+ f  R" W2 l. N# M1 a烟酸己可碱标记ES细胞进行移植. F# Y2 A% m/ S; @  Q- d% B2 C: `
1．准备一10μg/ml的烟酸已可碱染液（双苯酰亚胺，在冷冻室118）3 ?: r- E( C5 [
2．加入1mg（你能称到的最小量）到5ml EB培养基（制成200μg/ml）
5 E/ z/ i8 K; V3 ~+ N, _( `3．将溶液稀释成10μg/ml （100μl 200μg/ml 溶液和1.9ml EB培养基）  z1 K9 u4 t0 C
4．如前所述将细胞重悬于2ml烟酸已可碱染液而不是EB培养基中制备ES细胞悬液，0 L3 F3 b0 Q# C  O; E; k
5．将悬液置于室温（或冰上）30分钟
5 z- `! h# W) G$ Q3 b$ U6．离心2分钟
6 o4 ]3 z  C/ [: P7．吸出上清将细胞重悬于2ml EB培养基8 |1 p9 T$ N% y0 l* x) y
8．重复一次8 O+ t. m+ \8 O/ J& s( N$ h7 v
9．离心2分钟8 v, d# d" y0 R+ z
10．吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基并置于冰上。