|
- 积分
- 18
- 威望
- 18
- 包包
- 64
|
DNA萤光染色法
# w1 N" N+ i- G4 h/ i· 原理︰利用萤光染剂（bisbenzimide, Hoechst 33258）侦测支原体污染。此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。 # L! o9 Y& A% C0 l
· 测试步骤用间接步骤，将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种于指示细胞培养液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T6 cell），然后培养指示细胞再作萤光染色。正负反应对照组亦可以接种于indicator cell内作为对照。 . L9 b% x3 r9 d$ u3 o W1 N
· 待测细胞亦可作直接测试，但需为吸附型细胞，培养后直接作萤光染色。有些细胞易有萤光背景，而干扰结果判读，则建议使用接种于指示细胞之步骤。
/ y" ^; g7 B5 x. O6 j* a W8 c· 特点︰简单、经济与灵敏，广泛使用，可作为例行之侦测步骤。可以侦测不易培养之支原体，例如M. hyorhinis，较直接培养法快，约一星期即可知道结果。
- N9 S6 s+ r' o, V8 w· 缺点：有时仍会有萤光背景，影响判读。 ( R9 n$ ~% Y1 D* J# k
材料︰ 7 _# f0 P' b* B @& s0 W* I, |
· Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL 21250-014﹚、bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125)、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide (Nunc 177380)或chamber slide替代物：35 or 60mm sterile plate内放置无菌22x22mm盖玻片﹙浸于酒精内，使用前过火灭菌﹚，一般吸附型细胞均能吸附在盖玻片上。染色后取出盖玻片，细胞面朝下放在玻片上观察。 + C& Q0 K# \; C0 {) m
· Indicator cells: Vero (African green monkey kidney, ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070)，细胞须先测试无污染。αMEM with 10鸖 ( medium for Vero cell) ! A1 L2 c5 j1 j
配制试剂: ( a8 V$ Z6 _" p! n, D4 J% ~
· 无菌HBSS︰配制Hanks’ balanced salt solution，以0.22mm无菌过滤膜过滤灭菌。勿用高压蒸汽灭菌。
, U& f* {& C( t v0 G4 }· Hoechst 33258 stock solution（100X）︰称取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml无菌HBSS，置于棕色瓶中，室温下以电磁搅拌器搅拌30分钟至完全溶解后，以1ml分装至1.5ml小离心管中，贮存于-20℃。 0 {, k& f1 H$ [/ ?8 n. h( H
· Hoechst 33258 working reagent︰取1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室温下搅拌45分钟，置于棕色瓶中并以铝箔纸包覆，避免光照，贮存于4℃。
' y1 E' x# t0 |# _: ?· mounting solution︰22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合，以1 N NaOH调整pH至5.5（pH很重要），贮存于4℃。 0 z; W$ b2 Z% T, m- ^3 ^( R) }
· 固定溶液（fixative）︰冰醋酸与甲醇以1︰3之体积比例混合，使用前才配制。 2 K; ^: ?/ D, S- _
步骤：
* T0 S6 d' B( c# W! [3 d& v$ f· 培养Vero细胞： Vero细胞可作长期培养或制作多个冷冻保存管，测试前解冻培养。测试前一周培养Vero细胞。 / H. I9 b6 b8 i1 X* T' j
· 在接种测试样品前一日，以trypsin-EDTA溶液处理Vero细胞，制成细胞悬浮液，以1~2x10^4 cells／ml培养于chamber slide中，每个well加入1ml细胞悬浮液，于37℃, 5％CO2培养。隔日确定生长良好后，即可接种测试样品。 # X0 z9 L4 I7 Q/ {1 S+ B
· 接种测试样品：样品种类：1ml待测之培养基，1ml待测细胞培养液（可将细胞稍微刮下﹚，0.05~0.1ml冷冻管之细胞悬浮液。 8 L5 S! O; o# W! [
· 将测试样品加入chamber slide内，培养5天后，进行Hoechst 33258的萤光染色观察。 0 f: }! j4 J" O
· 以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero细胞作为正反应对照组﹙或是已感染支原体之细胞培养液或冷冻细胞液﹚，负反应对照组为Vero cell之新鲜培养基( αMEM 10鸖)。
. f; o1 t6 F: Z% T/ VDNA萤光染色检测︰
2 k7 N/ j0 V6 I+ I! J* T/ j· 取出培养5日之Vero细胞，吸除培养液。于每个well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液，静置10 min后，吸除固定液。重复上述之步骤，风干10分钟。 : j5 A$ F9 A+ a3 r& l( D! N$ r
· 于每个well中，加入1 ml Hoechst 33258 working solution，室温下静置30 min。
2 f$ {! V& O l' L6 a( `& w· 吸掉Hoechst 33258染液后，以无菌水洗涤3次，风干后加入1滴的mounting solution，并以盖玻片覆盖之。 % {4 _+ ~& {, b5 _9 m, P! q: z% S- n
· 以100x-400x萤光显微镜观察。打开水银光源10 min后，以UV激发光束(330～380 nm)之滤光镜，观察细胞核外是否有蓝色萤光小点或是丝状点之萤光物产生。
0 B& T% ^5 `5 `! w7 X结果判读︰. o' B- Y8 K. M3 u( h" _7 a" F
若有支原体污染，在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点或是丝状点。其形状一致，与细胞残片染成之不规则点状物不同。其萤光可维持数星期。
& U" X; @8 |1 K图例 (A)为negative result : 萤光显微镜下，只观察到Vero细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。(为positive result : 在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点和丝状点，表示测试样品有支原体的污染。 1 o. q% Q) `% |5 s4 o7 C
(A)Negative result 9 ^$ y) V' A. r1 A, L
萤光显微镜下，只观察到Vero细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。
: G7 J: o* d! M. h7 ^4 n
|
|
发表于 2009-6-17 20:37
发表于 2009-6-18 12:05
