细胞培养时支原体污染的PCR检测 - 实验室综合讨论区干细胞之家



免疫细胞治疗专区	欢迎关注干细胞微信公众号

返回列表

查看: 24014\|回复: 0	go [讨论] 细胞培养时支原体污染的PCR检测 [复制链接]

youyu

新手上路

Rank: 1

积分: 18
威望: 18
包包: 64

楼主

发表于 2009-6-17 20:40 |显示全部帖子 |倒序浏览 |打印

支原体菌株来源：M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原体,M.FermentaneATCC19989发酵支原体 ,M.SalivariumATCC23064唾液支原体 ,M.HominisATCC23114人型支原体 ,M.OraleATCC23714口腔支原体 ,M.HyorhinisATCC29052猪鼻支原体。其共同引物序列来自16s和23s保守区域，外部引物为Ｆ1 5′-ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴ-3′，Ｒ1 5′-ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴ-3′；内部引物为Ｆ2 5′-ＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴ-3′，Ｒ2 5′-ＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ-3′。) _8 m6 J+ c6 W/ k* l9 S( E: u, b

ＰＣＲ反应体系和条件：10×缓冲液(10ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ、500ｍＭＫＣｌ、20ｍＭＭｇＣｌ2、0.01%明胶)、ＰｒｉｍｅｒＦ1、Ｒ1、Ｆ2、Ｒ2的浓度为2ｎｍｏｌ/μＬ、2.5ｍＭｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ酶、Ｈ2Ｏ、石蜡油覆盖。反应温度和时间为:94℃/2ｍｉｎ预变性、94℃/30ｓ变性、55℃/1ｍｉｎ退火、72℃/1ｍｉｎ延伸,循环30次后72℃延伸5ｍｉｎ。第1次ＰＣＲ反应取模板10μＬ,第2次ＰＣＲ反应以第1次ＰＣＲ扩增产物为模板取1μＬ。 + }; G+ d4 {. w+ C" J1 F

下面有更详细的：/ X0 ?( C% P% A5 _  x8 f

污染测试--支原体 : PCR方法
原理：
利用具特殊专一性之primers，经由PCR反应来复制mycoplasma DNA。所用之primers来自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列，由于此段spacer之序列依mycoplsma种类不同而不同，因此可依所复制之DNA大小及其restriction fragment大小差异来作侦测与鉴定。+ y1 h1 t1 I- y) v
特点：灵敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 与快速(一天)。可侦测不易培养之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培养mycoplasma作为正反应对照组，避免可能之污染。0 J+ a. E, ]* h) V1 n4 d  A
缺点︰PCR反应很灵敏，易有伪阳性结果。此方法尚在评估中，故结果仅作为参考和内部品管之一部份。
材料与设备：
ATCC mycoplasma detection kit:可作50～100 reactions.
提供1st stage primer mixture与2nd stage primer mixture
positive control DNA (A. laidlawii ; M. pirum)
PCR reagents :+ W8 m4 a% l' k( k3 a+ Y
Taq polymerase ( 5 U / ul )# O) Y# B6 l/ |6 O6 Z) n3 d. g9 N
dNTP( dGTP, dCTP, dTTP, dATP, 1.25 mM each )0 |1 Y3 R3 q9 k) e  U) c& ^7 y
10x PCR buffer (with 1.5mM MgCl2); L: _1 O2 v# L3 j
25mM MgCl22 \7 d) }3 S: n9 v! S# W
sterile ddH2O) ]. @- i+ `, {/ A' j; A3 p
Machine / Equipment：
PCR thermal cycler# o2 [1 m! v5 T9 g+ S
agarose电泳设备
DNA电泳胶体观察设备% ~  {/ z( W  C+ U9 C
无菌PCR反应管
无菌1.5 ml微量离心管  X% R2 k- M; l: d3 h
无菌2ul, 20ul, 200ul, 1000ul Tips/ Pipetmans0 h& K" k; {: O, q) P
方法：: t9 r- O: f% x
此PCR反应是一种nested PCR，包括2阶段PCR反应，1st stage PCR结束后，取其反应物作2nd stage PCR，然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有无及片段大小来分析结果。1 h% _$ Z7 V( }: P/ U
结果：使用UV light观察，并照相记录。

" S) H& @: M2 N
不过应用较多还是巢式PCR! J/ e# |6 }: g$ T) k" P; I
# H# r  b  E# D! g
方法：  v1 B8 {1 T* i, ^
此PCR反应是一种nested PCR，包括2阶段PCR反应，1st stage PCR结束后，取其反应物作2nd stage PCR，然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有无及片段大小来分析结果。
结果：使用UV light观察，并照相记录。% p; _' m) a& n4 o4 ]2 q/ C

- `$ E8 D4 N* k
6 W) A7 a. W/ w7 h! o+ D7 g
方法再详尽点:+ p& n3 ^2 d* H/ i9 j5 k- [+ y

3.1 1st stage PCR reaction（total volume 25 ul）：2 G, |6 P- P" S2 @' F
3.1.1 测试样品 ( 2 ul / each )
3.1.1.1 直接取样测试细胞之培养液。1 f# K9 k( q$ J  S$ S4 N  P
3.1.1.2 Positive control : mycoplasma DNA ( A. laidlawii ; M. pirum )
3.1.1.3 Negative control : ddH2O
3.1.2 Reaction mixture ( 23 ul / each )( c) M6 L8 t4 s: F" c/ m
3.1.2.1 10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul
3.1.2.2 1st stage primer mixture 0.5 ul
3.1.2.3 dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 l6 ]7 E1 L  t) n4 q% Q# }3 k
3.1.2.4 MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul
3.1.2.5 Taq DNA polymerase ( 5 U/ul ) 0.1 ul
3.1.2.6 ddH2O 18.4 ul% }: s  w! g  L4 c6 ~5 c0 u
3.1.3 PCR program ( 1st PCR与2 nd PCR相同)：使用PCR thermal cycler( n  K2 y- Y- _6 j
3.1.3.1 step 1 : denaturation: 94 ℃ 30 sec. o4 S; Y; V  O3 ^$ _
3.1.3.2 step 2 : denaturation: 94 ℃ 30 sec3 `' Q& g. O" x7 z* J( t; W' x
3.1.3.3 step 3 : annealing: 55 ℃ 2 min
3.1.3.4 step 4 : extension: 72 ℃ 2 min
3.1.3.5 重复3.1.3.2至3.1.3.4步骤30 cycles
3.1.3.6 step 5 : final extension 72 ℃ 5 min : ^0 y: y6 O, {7 f
3.2 2 nd stage PCR reaction（total volume 25 ul）9 ~7 v% _$ k# Z" Y. I' I3 S
3.2.1 测试样品：1st stage PCR product（1 ul / each）。7 l! U) n9 l* {$ y- l; ]6 M
3.2.2 Reaction mixture ( 24 ul / each )
3.3.2.1 10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul
3.3.2.2 2 nd stage primer mixture 0.5 ul6 S8 ^* r+ y4 h6 c- m7 p/ V
3.3.2.3 dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 ul
3.3.2.4 MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul
3.3.2.5 Taq DNA polymerase ( 5U/ul ) 0.1 ul
3.3.2.6 ddH2O 19.4 ul
3.2.3 PCR program同3.1.3；使用PCR thermal cycler2 V3 v1 f+ r  `
$ @! C' u; E- s9 G
4.0 胶片电泳分析   ]5 l: w; m. d" M' h3 A
4.1 胶片 (2.0%) 置备: 将2 g agarose溶于100 ml ( 1x ) TAE buffer。% y5 I' f% ?1 M$ M
4.2 电泳液：(1x) TAE buffer（Tris-acetate/EDTA electropheresis buffer）" B9 [$ F+ ^7 B1 V9 g
4.3 选择100~500 bp DNA size Marker：取100 bp ladder Marker 5 ul ( 25 ng/ul )
4.4 取10 ul 2 nd stage PCR产物分析，各加入2 ul ( 6x ) loading dye。
4.5 进行电泳分离100V, 25 min。
4.6 胶片染色：ethidium bromide染色10 min，H2O退染10mim。（EtBr为致癌物质，请戴手套并小心操作）
4.7 结果：使用UV light观察，并照相记录。

Figure 1 : Agarose gel electrophoresis of the 2nd -stage PCR Products from eight commonly encountered Mycoplasma and A. laidlawii Species. ( from ATCC mycoplasma detection kit)

回复引用

关闭 安全验证

[讨论] 细胞培养时支原体污染的PCR检测 [复制链接]

关闭安全验证