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支原体菌株来源：M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原体,M.FermentaneATCC19989发酵支原体 ,M.SalivariumATCC23064唾液支原体 ,M.HominisATCC23114人型支原体 ,M.OraleATCC23714口腔支原体 ,M.HyorhinisATCC29052猪鼻支原体。其共同引物序列来自16s和23s保守区域，外部引物为Ｆ1 5′-ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴ-3′，Ｒ1 5′-ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴ-3′；内部引物为 Ｆ2 5′-ＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴ-3′，Ｒ2 5′-ＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ-3′。
, E, c" U$ {$ B2 O
8 _/ @# e5 s( b$ Q7 F1 HＰＣＲ反应体系和条件：10×缓冲液(10ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ、500ｍＭＫＣｌ、20ｍＭＭｇＣｌ2、0.01%明胶)、ＰｒｉｍｅｒＦ1、Ｒ1、Ｆ2、Ｒ2的浓度为2ｎｍｏｌ/μＬ、2.5ｍＭｄ ＮＴＰｓ、Ｔａｑ酶、Ｈ2Ｏ、石蜡油覆盖。反应温度和时间为:94℃/2ｍｉｎ预变性、94℃/30ｓ变性、55℃/1ｍｉｎ退火、72℃/1ｍｉｎ延伸,循环30次后72℃延伸5ｍｉｎ。第1次ＰＣＲ反应取模板10μＬ,第2次ＰＣＲ反应以第1次ＰＣＲ扩增产物为模板取1μＬ。
; i8 `% N9 O5 E' y6 ?& K) g6 Y8 W: k# S( x7 W5 R* D
下面有更详细的：
9 L2 }- K3 E$ B; X) B$ B- ~
$ u, d' h) g) J污染测试--支原体 : PCR方法
6 E( G9 s! @& Q8 J3 O# ]原理：8 y4 X+ Z. u' ?' N% E
利用具特殊专一性之primers，经由PCR反应来复制mycoplasma DNA。所用之primers来自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列，由于此段spacer之序列依mycoplsma种类不同而不同，因此可依所复制之DNA大小及其restriction fragment大小差异来作侦测与鉴定。: I: m6 w$ C: ]
特点：灵敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 与快速(一天)。可侦测不易培养之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培养mycoplasma作为正反应对照组，避免可能之污染。
7 ]/ B2 p: Z' w* B) f缺点︰PCR反应很灵敏，易有伪阳性结果。此方法尚在评估中，故结果仅作为参考和内部品管之一部份。' G& p, S a8 b8 `+ u' ?
材料与设备：& \6 } r7 J! g
ATCC mycoplasma detection kit:可作50～100 reactions.1 S V. ^/ A6 Y" f7 m. p- P* q
提供1st stage primer mixture与2nd stage primer mixture
A+ [- o$ Y0 T) |+ gpositive control DNA (A. laidlawii ; M. pirum)/ y. Z8 @* D5 ^) F5 G
PCR reagents :! _. h4 ~# j% |( b( @( P
Taq polymerase ( 5 U / ul )2 a) p) \6 i. F: R
dNTP( dGTP, dCTP, dTTP, dATP, 1.25 mM each )
- ]* z2 x, I7 i, y0 a; B B8 y10x PCR buffer (with 1.5mM MgCl2)
: [# @, E/ m2 _' ~: u# L25mM MgCl2% q, R5 |+ j/ }. A" }4 b
sterile ddH2O8 W8 W# d/ U. d7 K
Machine / Equipment：8 G' q% z9 `5 e- _
PCR thermal cycler
' _* y# M1 V" ragarose电泳设备$ j# P. W$ @+ v" Y9 M" r4 l
DNA电泳胶体观察设备9 e& t: {9 p2 W: e* `6 d$ i
无菌PCR反应管) P- s6 l6 ~: Z( @5 Z
无菌1.5 ml微量离心管
5 v7 q* u# Q8 D6 }- M/ k5 N" e无菌2ul, 20ul, 200ul, 1000ul Tips/ Pipetmans8 \$ m, |9 w; }. y, c/ k
方法： \- l5 P8 F$ u
此PCR反应是一种nested PCR，包括2阶段PCR反应，1st stage PCR结束后，取其反应物作2nd stage PCR，然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有无及片段大小来分析结果。
3 C! a5 W9 C3 C" Z# c0 W2 g结果：使用UV light观察，并照相记录。
$ {, g; d7 j6 C0 b3 I( U
0 |8 G1 x z% d$ \
) f1 N6 E/ m: C) ~% X/ M不过应用较多还是巢式PCR
# M) n x9 @/ O$ c0 H2 T7 {% {# d+ I7 S6 W+ _' v
方法：0 Q# L5 c4 D' ^; U# G" }
此PCR反应是一种nested PCR，包括2阶段PCR反应，1st stage PCR结束后，取其反应物作2nd stage PCR，然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有无及片段大小来分析结果。2 N9 H" z- Y2 f( X% {% n
结果：使用UV light观察，并照相记录。
0 s- _1 w M3 }5 N( x- c! H/ D% ^* s6 I, Z: T& s
* @9 W& H, }. i; B( v
$ e, s. s; m6 f% e7 k1 G2 N
方法再详尽点:
$ c6 Z5 ?% G, {$ u7 B
. q. R f+ t3 D' i$ R3.1 1st stage PCR reaction（total volume 25 ul）：0 s& b( w; D" I \0 R; L
3.1.1 测试样品 ( 2 ul / each )
0 O0 |" {" O4 H1 X! d4 I* |3.1.1.1 直接取样测试细胞之培养液。- l( ~2 p+ R) ^; D* D0 N
3.1.1.2 Positive control : mycoplasma DNA ( A. laidlawii ; M. pirum )
" f. I1 v2 {; B0 K# y9 U3.1.1.3 Negative control : ddH2O
' V! \5 h2 ]' H: z3.1.2 Reaction mixture ( 23 ul / each )$ b4 E! N6 @$ V- z
3.1.2.1 10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul
2 w7 c+ P* C, g8 y6 C! @7 J }3.1.2.2 1st stage primer mixture 0.5 ul
; @/ w) x: c- w9 P" G' A- H% r3.1.2.3 dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 l
# B8 t- e/ k2 ]2 h+ E. h3.1.2.4 MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul7 X* J: k0 H( ]" z4 j% g' B& {
3.1.2.5 Taq DNA polymerase ( 5 U/ul ) 0.1 ul
$ c- C" u- m. R. ]' I3.1.2.6 ddH2O 18.4 ul
2 a# j: `7 e6 l3.1.3 PCR program ( 1st PCR与2 nd PCR相同)：使用PCR thermal cycler, k3 i) {2 F7 [: C
3.1.3.1 step 1 : denaturation: 94 ℃ 30 sec4 E5 Z- e8 E. G! n" N$ n+ ?
3.1.3.2 step 2 : denaturation: 94 ℃ 30 sec
& v3 i, Q; }% K% z$ O: X3.1.3.3 step 3 : annealing: 55 ℃ 2 min / U3 w: c. ]% U% Z& i7 ^% {+ J
3.1.3.4 step 4 : extension: 72 ℃ 2 min
" o! U' r% i6 f) K3.1.3.5 重复3.1.3.2至3.1.3.4步骤30 cycles9 Q$ N) s, V' W/ l l4 D; E. x2 s) D
3.1.3.6 step 5 : final extension 72 ℃ 5 min " ]3 ^# \* ^& m5 G
3.2 2 nd stage PCR reaction（total volume 25 ul）
( t$ @$ v! B) v: q. [; i3.2.1 测试样品：1st stage PCR product（1 ul / each）。/ Q, ^2 G( {3 Z8 ]# J
3.2.2 Reaction mixture ( 24 ul / each )
$ y8 x+ {" m0 C1 p9 r& V3.3.2.1 10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul) X6 U3 E* C: j* n6 j' \
3.3.2.2 2 nd stage primer mixture 0.5 ul3 R$ i( j2 r7 N* a2 b2 M
3.3.2.3 dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 ul/ J) E6 N7 G, g
3.3.2.4 MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul# |: k; Y: u7 [, w6 F; Q
3.3.2.5 Taq DNA polymerase ( 5U/ul ) 0.1 ul9 q/ L w5 i4 I$ l& l8 Q& c
3.3.2.6 ddH2O 19.4 ul
& [" m- D: P7 `3.2.3 PCR program同3.1.3；使用PCR thermal cycler' m' V1 W1 q! b3 ]1 `( e5 Z
, a% t" G# T7 |. Z0 Z
4.0 胶片电泳分析 ' s# K8 d, }6 }+ ~/ {0 W- x' Y
4.1 胶片 (2.0%) 置备: 将2 g agarose溶于100 ml ( 1x ) TAE buffer。
+ B P! `; [+ K! B2 J4.2 电泳液：(1x) TAE buffer（Tris-acetate/EDTA electropheresis buffer）( G5 i$ o1 O) M5 }! j
4.3 选择100~500 bp DNA size Marker：取100 bp ladder Marker 5 ul ( 25 ng/ul )* r. t6 D$ G! ^/ f" A7 S4 c; a
4.4 取10 ul 2 nd stage PCR产物分析，各加入2 ul ( 6x ) loading dye。
& h! b8 a/ [" J% R' M4.5 进行电泳分离100V, 25 min。- m* ~7 Z, e* @9 b: \. e% D d
4.6 胶片染色：ethidium bromide染色10 min，H2O退染10mim。（EtBr为致癌物质，请戴手套并小心操作）# x# ^9 T# ?0 o5 N" x
4.7 结果：使用UV light观察，并照相记录。
: E( j$ s, Z+ w- j! Z5 u' `- \
. g- [8 T! k+ l1 S7 c% z- ]0 ~" I- ~0 y6 z! T: t, h
Figure 1 : Agarose gel electrophoresis of the 2nd -stage PCR Products from eight commonly encountered Mycoplasma and A. laidlawii Species. ( from ATCC mycoplasma detection kit) # k$ H# y/ \4 n+ B1 R- n2 d
0 }8 k0 T3 q% |! g @7 A# ~# n
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发表于 2009-6-17 20:40
发表于 2009-6-18 11:56
