细胞培养时支原体污染的特点及检验的笔记

youyu

最近看大家常提到支原体污染，就翻了翻书，做了些笔记，现在贴出来和大家分享：
  U& N% `" G7 d  V# G& I& i8 V支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0．2um)并独立生活的微生物．约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性．可为圆形、丝状或梨形。 ) d6 G( f  E3 B3 a- [/ [
支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构．其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群
( I# D& ?) e  `或中央束。
8 l# v. _! b( e! ^9 b6 R支原体代谢需固醇类物质、部分种类需要精氨酸、O 2或葡萄糖，每一种支原体都有自身持点。多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7．6—8．0)，对酸耐受性差。对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。 3 M, ?- N/ l  x3 O: v
支原体污染细胞后．培养液可不发生混浊．多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解．因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢．甚至从培养器皿脱落。 8 W6 H) j3 X( }6 l; A- m/ z
为确定有无支原体污染可做如下检酗： 3 R2 Z  r. F$ P- _
①相差显微境检测：将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察．支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。
) A0 l. C6 ~1 Y% f& p- E0 b! c②荧光染色法：荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不合酚红的Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理盐水漂洗．置于用生理盐水配浓度为50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min．向细胞面滴加pH5．5磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。
, v0 y0 U- f6 L4 y: Q③电镜检查；用扫描电镜方法简便快速．也可以利用透射电镜。
  l) J: r, P) I8 G, P! i) G2 Z, D6 v( R④DNA分子条文检查或支原体培养等方法：检出率高．但方法较为复杂 - C/ T' U$ G) N4 t/ B
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支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3-0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。它不同于细胞，也不同于病毒。支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长，营养要求比细菌高。
) ^6 I. n5 k' Q: _5 \& X6 M) o细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。在细胞培养中支原体感染发生率达到63%，支原体感染发生后能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达，又不能通过可视法对其进行检测，而且它对细胞的生长率影响较小，不易引起注意。国内外研究表明，95％以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和莱氏无胆甾原体（A.laidlawii），为牛源性。以上是最常见的污染细胞培养的支原体菌群，但能够污染细胞的支原体种类是很多的，国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。
9 @5 `0 r, J3 ~: \( i, t支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（一些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。
2 O; c3 s+ d0 i# q组织细胞培养工作中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如 -内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺药物普遍耐药。对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮；其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用，所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。InvivoGen公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Plasmocin能有效地杀灭支原体，不影响细胞本身的代谢，并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞，不会重新感染支原体。

carfan

本实验室长期受到支原体，或者姑且称“黑胶虫”的困扰，说说个人经验：
& h8 o) u, y$ ^3 r9 g0 {! [1. 遇到细胞膜上黏附40倍镜下可见的小黑点，且布朗运动，则轻度怀疑。. ?; Q) c" c# r) @
2. pbs反复清洗看看是否能够缓解或清除，可以则不是污染。不幸则中度怀疑。& O) \% L  M; e6 R5 p
3. 爬片hochest33258染色，荧光显微镜40或者100倍照片，如果核外有蓝色亮点，则高度怀疑。( t; J4 {4 m( k# A" [/ r% P1 {1 u
4. 支原体pcr检测试剂盒，检测细胞上清。阳性阴性必须对照，不幸则严重怀疑。  I( k, C2 n- |1 g
5. 什么温度改变，什么抗生素都是没有作用的，个人认为肿瘤细胞裸鼠移植成瘤再培养可行；非肿瘤细胞，不用浪费时间和经费，彻底销毁处理，购买的可以留种投诉，进口的估计没有问题，国内的使劲扯皮吧。
% b: G% r8 O. ?0 t6 S6. 遇到上述情况还要做干细胞研究，个人做法是换新正压洁净实验室，新hepa过滤进口培养箱，新冻存罐，所有液体进口，耗材物品进口一次性。建设经费不够还要做干细胞，只能去别的实验室合作客座。' J, E) Q; ^2 u7 _" h
7. InvivoGen的M-Plasmocin我也用过，可以抑制支原体，高剂量影响细胞生长，并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞，还是会重新感染支原体。干细胞建议可以先加入预防，我们的干细胞什么也不加。7 i$ R( H$ @' C- Z' [
个人经验，不科学，欢迎讨论，公司的托别来。

hualin840518

不错！

hualin840518

谢谢分享！

douhw

很难得，相当感谢！

sacia

也曾遇到过相同问题，谢谢版主慷慨分享

xlxing

xie xie share

mmssyyee

感谢分享，那再请教一下在200倍显微镜下观察到细胞之间的小黑点点，有时会发现在运动，这种是所谓的黑胶虫吗？还是细胞代谢废物啊？

hany2007

我用40微克每毫升的剂量加入庆大霉素，可以起一定作用，最近在试小鼠移植瘤处理，希望能清除掉

lixiaodong

Thanks.