影响转染效率的主要因素

sailboat

影响转染效率的主要因素( t  E* ^  |; G# J0 p( y: Z
1.细胞培养物
% V7 V3 g9 C- l6 [+ l: _) f* }8 T( |健康的细胞培养物是成功转染的基础。
. P; w& ]: `1 Y$ W" H; R不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。9 @" d: b% `7 u- X7 w! `
高的转染效率需要一定的细胞密度，一般推荐在转染前24小时将细胞传代，这样可提供正常细胞代谢，增加对外源DNA摄入的可能。3 Q  p, y& ^1 K4 f: @
另外一定要避免细菌、支原体或真菌的污染。' M% o0 ]7 F, i6 ~# e
2.血清& |2 G+ @3 [* o8 \# I6 ~" Q
大多数培养基在使用前需要加血清。通常血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。; D$ l  q) E6 L: o5 e& n
血清质量的变化直接影响转染效率。因此在转染前建议先测试出对细胞生长良好的血清批号，转染时用同一批号的血清，并同时做负对照（不加转染试剂及外源DNA）以测试细胞生长是否正常。6 U& c5 }- M  p3 Y& H% m6 N* B6 f
有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低，因此在转染前要除血清。但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡导致转染效率极低。* P. f% E$ S7 X7 B- T* j
3.载体构建/ e9 }7 g) k" ?$ l
转染载体的构建（病毒载体，质粒DNA、RNA、PCR产物、寡核苷酸等）也影响转染结果。) G) j) Z/ t% N5 m. C. [0 ~6 n; k
病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定的细胞周期，此外还需考虑一些安全问题（如基因污染）。
% ?' R# I  l( x( |; A: i8 x除载体构建外，载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响，超螺旋质粒DNA效率最高，线性DNA导入效率不如超螺旋DNA，但整合到染色体效率较高。
1 ^) C2 @9 \+ ?% H' k4 K如果基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行，因此选择组成及合适的启动子也很重要，同时做空载体及其它基因相同载体构建的正对照可排除毒性影响的干扰。1 L6 }' w7 L( T- o& F
4.DNA质量
0 l' {0 E& m+ w. I! k: J" Z, ADNA质量对转染效率影响非常大。
3 b0 p$ H9 I2 ]6 d1 e) G一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，带少量的盐离子、蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。2 U7 @( J* S) a& c
此外，对一些内毒素敏感的细胞（如原代细胞，悬浮细胞和造血细胞），为保证理想的转染效果必须无内毒素污染。
0 c% |8 J( S+ l  M" N$ R+ T5.转染技术
( w- j5 b8 I4 t转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。
! B' a1 Z2 h7 i4 I注意事项
% Z3 c* H: t5 z' D. f: w无菌操作，防止细菌和霉菌污染1 c9 ]" T' O. O; L9 p+ r
消化细胞及换培养液时防止大片细胞被冲掉
- @$ P# j% H0 s* s% y( V/ n( z5 N/ [! ]) y8 {5 m7 F) `
应用范围* }: u, d5 E2 M  U( q6 o. T
质粒DNA：3 h0 R; W' k  }& m; T* G3 |% }
  基因突变分析
# o( U! s* @0 p, x9 |$ G  调控元件的研究+ E2 A- C! I& z0 \; Q
  基因表达研究+ ?) Z* [, c5 D6 _$ I" t3 P% L
  细胞生长调控研究
; e3 G9 E! H$ _5 t+ N9 E* l  蛋白表达纯化% j( K. N( G# w" a) s
寡核苷酸：
9 j* U9 G; j5 N+ O6 c2 h( k反义RNA实验和基因治疗
/ }: {4 R( `( Q0 C- R- \RNA：' S7 l7 m5 r6 J1 R9 r0 B3 |
转染非分裂细胞
: l2 C" l8 Q: e/ cRNA病毒的研究! q; K5 [* k9 l5 s* t" u6 a4 f
RNA翻译的研究0 p' P; ?2 p  X9 R3 x# `* {6 M6 _
反义RNA的研究
# ]; v' I) Z- d9 LRNA干涉的研究

carfan

我们主要做脂质体lipo2000转染，个人认为：! k/ K' Q) H' ~
1，细胞状态必须很好，转染前用含血清培养至90%融合时，pbs清洗后换转染商品化的opti培养基，转染8-12h后换回完全培养基加抗生素。: f" ]+ \' i" ~2 w' f4 A% S) N6 W
2，DNA最好用试剂盒提取纯化，无内毒素。% a: q( e9 o, s+ Q
3，DNA和lipo的比例最好梯度摸条件，再加上转染时间优化组合。. Y8 i, S5 f4 o6 a$ G
4，细胞系不同，质粒大小不同，效率不同，都得摸条件，然后固定条件，便于重复。1 }$ k1 f& m7 Z  K
5，为省钱lipo用量对应的减半效果差不多。
/ O" @% @. @; Q8 g% `, \: H/ `我们这样能够做到lipo转肿瘤细胞24h，细胞也没有漂的。现在有耐血清lipo不用换液更方便。2 P$ a$ ?2 S6 ^: J% ?4 U& _5 q
活体动物组织转染，我们的经验是lipo毒性大，有效性差，建议换其他的阳离子转染试剂，PEI很好就是太贵。

immunocell

1# sailboat 6 A. T: ^2 D$ p" j
9 ]$ F# w- n$ X8 R, I+ C2 k6 x
* T, o3 ]- q/ L, M/ y
学习学习

zzdqyaya

很好的经验，收藏了。

sacia

谢谢你们的宝贵经验！!

kgy

どうも% [. }7 @2 N$ |3 R& @3 x; R

weiyepan

回复 carfan 的帖子7 A7 R1 y$ C% i$ B9 N, [' n* ~
* y7 y  b* _& A, Y/ d5 A$ J# Q
其实PEI比lipo成本便宜太多，自己去sigma看看。。。