如何养好人的胚胎干细胞

lchanlon

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0 ]8 f  J! s$ h  D' E/ F个人觉得想养好细胞最好的办法就是多养多练习。我养人的胚胎干细胞和人的iPSCs有几年了。Feeder 和 Feeder free的都用过， Feeder free的比较省事就用二楼说的Stem Cell Tech的E8培养基，效果很好的。不过E8培养基不便宜的。所以我都是自己配制的E8。能够很好的维持胚胎干细胞的干性。最近我做一个CRISPR筛选的课题。先用CRISPR在人的H9胚胎干细胞上敲除了TP53基因然后筛选CRISPR library。染了几个maker，都挺正常的.( X4 E9 B7 a& [, |" _, {, m, q
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lchanlon

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If you do single clone, feeder might be a better choice.

lchanlon

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3 @5 o/ ]6 O; ?" M4 O  Z! UI exactly follow the nature protocol paper. Works very well. 20ng/ml FGF2 is enough to maintain cell pluripotency.
/ d0 o1 B" J6 a6 m1 K+ A# F0 u4 H  ?% C  X  @& ]& L* D

lchanlon

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9 {$ i" N& K& a. {" f. a6 z- z4 M, m, O3 Q3 W; R, G' F; H
你的细胞可能养的老了over confluent. 最好重新复苏一支新的细胞。What i did is putting 0.5 mg of Matrigel into 9ml of PBS or DMEM/F12 (cold), Mix it well, disperse 1.5 ml of mixture to one well of six-well plate. Incubating at 37C CO2 incubator for 30 minutes at least. For EDTA digestion, 0.5-0.6 mM EDTA is good. If cells were hard to detach from plate, that means cells have problem.

lchanlon

回复 吃呆猫 的帖子- N4 m4 O8 B. M8 G, r0 t

  g. c2 F6 Y% F( f! ?2 s( ?最好能浓缩一下病毒。我是这样做的" L6 W  K3 E& m7 }7 u: p
（1）在培养基中加入ROCK（浓度10 uM）处理H9 ESC至少三个小时。
+ y( `  Q' i6 L（2）用TrypLE 消化成单个细胞。/ ^( f3 X3 O# j  }. `
（3）把消化好的单个细胞 ＋ 病毒 ＋ ROCK (10 uM) ＋ polybrene (6 ug/ml) 加入到Matrigel包好的板子。6 Y+ [$ `$ W( W% i+ _' s: E1 J- E
（4）37C， 5% 培养6个小时，去掉病毒，换成新的培养基。

lchanlon

回复 吃呆猫 的帖子9 C" X& h3 V: @: C6 i

+ s- b% A# r) G不用担心，很容易做的。人类的胚胎干细胞两个小时就能贴壁了。也可以用病毒处理已经贴壁的细胞。我用0.4 ug/ml puromycin to do selection.