如何养好人的胚胎干细胞

stemcellsummer

请教各位大神如何在饲养层上养好人的胚胎干细胞啊！feeder用的是什么品系的老鼠啊?非常感谢！

amyliu

现在都用无feeder的培养基了，例如life的E8，stem cells technology的也有，如果你一定用feeder的话，我们以前都是用的ICR小鼠的12.5或13.5天的ICR的小鼠制作的。希望能帮助你。

lchanlon

回复 stemcellsummer 的帖子7 w8 W6 P. \6 g; l% H

& r, Y/ D  j' b  w个人觉得想养好细胞最好的办法就是多养多练习。我养人的胚胎干细胞和人的iPSCs有几年了。Feeder 和 Feeder free的都用过， Feeder free的比较省事就用二楼说的Stem Cell Tech的E8培养基，效果很好的。不过E8培养基不便宜的。所以我都是自己配制的E8。能够很好的维持胚胎干细胞的干性。最近我做一个CRISPR筛选的课题。先用CRISPR在人的H9胚胎干细胞上敲除了TP53基因然后筛选CRISPR library。染了几个maker，都挺正常的.
4 y& C6 B3 I7 C# a7 E7 P3 m- E# X) Z8 F+ k+ {3 m

$ S* ?. U% i8 f- R3 H
+ w* Q0 T0 p  ?* K: f- b+ v

anning111

很难得到单克隆

lchanlon

回复 anning111 的帖子8 c/ R$ W9 ^; J  Q1 H

$ `, Q" `. c+ ^( K% JIf you do single clone, feeder might be a better choice.

吃呆猫

回复 lchanlon 的帖子8 N, a+ j# L, u+ W
- J5 N" s; I4 ~: l
你好，请教下，我养h9到D3，D4天会飘起来，是怎么回事，用的stem cell的E8，matrigel 1:30铺板，传代加Y27634。用EDTA消化，但每次传代细胞特别难刮下来，死的还特别多，而且到了D3，D4还会飘起来，是怎么回事？

innatestem

回复 lchanlon 的帖子# h/ D6 D& T, {) V% U

: N' |( @; i- c! }& o0 W' P1.你们实验室自己配置的E8，能否分享一下E8的主要成分有哪些哈？
' z9 }- J; Z* X2 z2.你培养人的胚胎干细胞这么多年有哪些心得体会，能否给战友们分享一下？不胜感激~

lchanlon

* ^) ~- G5 q1 P

* {7 A5 z1 E* n/ U) e4 d0 d) ^4 _) P回复 innatestem 的帖子
2 V7 [) i$ \/ M- P
7 {+ n/ U& `+ cI exactly follow the nature protocol paper. Works very well. 20ng/ml FGF2 is enough to maintain cell pluripotency.
) x& V- M8 B# T7 d. [% d' ]: P! X9 I8 q9 c

lchanlon

回复 吃呆猫 的帖子1 T* z7 ]" `9 g) v* f* N; C2 t

$ c3 C# ^& }2 x+ [  v你的细胞可能养的老了over confluent. 最好重新复苏一支新的细胞。What i did is putting 0.5 mg of Matrigel into 9ml of PBS or DMEM/F12 (cold), Mix it well, disperse 1.5 ml of mixture to one well of six-well plate. Incubating at 37C CO2 incubator for 30 minutes at least. For EDTA digestion, 0.5-0.6 mM EDTA is good. If cells were hard to detach from plate, that means cells have problem.

吃呆猫

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) K5 ^# q. T+ G8 B1 c; v: I% z  Q3 ^$ j0 W4 P2 l
知道原因了，谢谢