如何养好人的胚胎干细胞

stemcellsummer

请教各位大神如何在饲养层上养好人的胚胎干细胞啊！feeder用的是什么品系的老鼠啊?非常感谢！

amyliu

现在都用无feeder的培养基了，例如life的E8，stem cells technology的也有，如果你一定用feeder的话，我们以前都是用的ICR小鼠的12.5或13.5天的ICR的小鼠制作的。希望能帮助你。

lchanlon

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4 z3 }( y/ x9 x6 I  Z1 f7 z( R9 p" O9 G) [+ t/ e
个人觉得想养好细胞最好的办法就是多养多练习。我养人的胚胎干细胞和人的iPSCs有几年了。Feeder 和 Feeder free的都用过， Feeder free的比较省事就用二楼说的Stem Cell Tech的E8培养基，效果很好的。不过E8培养基不便宜的。所以我都是自己配制的E8。能够很好的维持胚胎干细胞的干性。最近我做一个CRISPR筛选的课题。先用CRISPR在人的H9胚胎干细胞上敲除了TP53基因然后筛选CRISPR library。染了几个maker，都挺正常的.3 t9 n: {  }( F

0 F6 A) i* F9 K0 l( w  s7 j& F
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anning111

很难得到单克隆

lchanlon

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2 k6 w  z7 ~& q( [) y: U; ]4 `6 N1 K+ K, Y4 q, Q0 w
If you do single clone, feeder might be a better choice.

吃呆猫

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0 g! U7 I) A+ W& F/ Y8 n5 T' K- }$ G/ l
你好，请教下，我养h9到D3，D4天会飘起来，是怎么回事，用的stem cell的E8，matrigel 1:30铺板，传代加Y27634。用EDTA消化，但每次传代细胞特别难刮下来，死的还特别多，而且到了D3，D4还会飘起来，是怎么回事？

innatestem

回复 lchanlon 的帖子% P: P; W# j7 I+ u9 n; F. g

; S; E7 r$ t; X1.你们实验室自己配置的E8，能否分享一下E8的主要成分有哪些哈？
4 [8 a  M) T5 K' j2.你培养人的胚胎干细胞这么多年有哪些心得体会，能否给战友们分享一下？不胜感激~

lchanlon

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! H6 U, B$ }$ E" t9 x4 B& b" y回复 innatestem 的帖子
1 C' y. g; r& O2 H. I; l6 u! e5 v+ ?4 @$ `+ Z
I exactly follow the nature protocol paper. Works very well. 20ng/ml FGF2 is enough to maintain cell pluripotency.
" S& i- J( N: Z/ u" t  v  W, W9 `+ d; l6 K

lchanlon

回复 吃呆猫 的帖子, l0 E% O5 ?- f  U  q6 f8 ^1 I/ r4 u
4 X4 Z# B- s- y  y, m8 u. |
你的细胞可能养的老了over confluent. 最好重新复苏一支新的细胞。What i did is putting 0.5 mg of Matrigel into 9ml of PBS or DMEM/F12 (cold), Mix it well, disperse 1.5 ml of mixture to one well of six-well plate. Incubating at 37C CO2 incubator for 30 minutes at least. For EDTA digestion, 0.5-0.6 mM EDTA is good. If cells were hard to detach from plate, that means cells have problem.

吃呆猫

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, d' ~( D2 i- c! D1 M6 A. q知道原因了，谢谢