干细胞培养工具盘点

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如今，干细胞研究不再是“高大上”的代名词，随着更多试剂和工具的出现，它已慢慢普及。研究人员能够让分化的细胞回到多能状态，让诱导多能干细胞（iPSC）与胚胎干细胞几乎没有区别，让这些细胞几乎永远生长。那么，我们来看看研究人员是如何维持多能干细胞的。
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* r3 t8 z! z* F, g# ]6 [; G出于各种各样的目的，研究人员培养和使用多能干细胞（PSC）。也许他们想了解多能干细胞的基础生物学，也许他们希望获得分化的细胞、组织和器官。由于干细胞可来源于不同的群体，它们在疾病治疗和药物开发上拥有巨大潜力。
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国际干细胞研究协会（ISSCR）的主席、霍华德休斯医学研究所的Sean J. Morrison表示：“细胞免疫治疗和改造T细胞（CAR T细胞）的进展让人激动不已，这是开创性的研究，将带来更好的基因和细胞治疗。”
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如今，干细胞研究不再是“高大上”的代名词，随着更多试剂和工具的出现，它已慢慢普及。研究人员能够让分化的细胞回到多能状态，让诱导多能干细胞（iPSC）与胚胎干细胞几乎没有区别，让这些细胞几乎永远生长。那么，我们来看看研究人员是如何维持多能干细胞的。
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; Z9 e( U$ {+ N# C5 E滋养层
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! U9 d7 v/ H5 f# F% @* C多能干细胞不喜欢单独待在不太熟悉的地方，换句话说，它们需要一些家的感觉。许多研究人员使用小鼠的胚胎成纤维细胞（MEF）作为滋养层细胞，以支持PSC克隆的生长。不过MEF分泌不确定的异源蛋白及其他物质，使得一些研究人员不得不去寻找替代品，比如人源的胚胎和成体细胞。尽管这些并非异源的，但它们也可能将不确定的因素引入培养。4 @: B% ]4 N+ T0 j

8 r+ ]" f4 t" `% B' l对多能干细胞而言，最常用的基质也许是Matrigel，这种基底膜提取物来自小鼠肉瘤，由Corning生产和销售，但其他供应商也提供类似产品。不过据奥克兰大学生物科学的助理教授Luis Villa-Diaz介绍，与MEF类似，Matrigel也是一种异源产物，并非完全限定的，存在批次之间的差异。“它表现不错，但有一些变化。”! Z3 d7 Z' u2 Y: c
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一些研究人员则以重组蛋白作为他们的基质：“层粘连蛋白和纤维连接蛋白似乎在人类干细胞研究中最受欢迎，玻璃粘连蛋白也挺受欢迎，”Biological Industries的技术培训经理Lia Kent指出。特定亚型（如层粘连蛋白-521）或片段经常被使用。
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合成的基质也被使用。例如，Corning提供了培养瓶、多孔板和微载体，其上包被了Synthemax以及浓缩的Synthemax II-SC基质。据介绍，这种易于使用的材料创建了一个独特的合成表面，模拟了天然的细胞环境。/ D, Q( }, w4 T
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培养基
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) M! R' I9 ?7 `4 T0 G* b$ U有些干细胞培养使用血清，它们含有多种成分，其中一些是未知的。有些则使用更限定（但不完全限定）的血清替代物，通常含有血清白蛋白及其他动物来源的产物。这些可从多家供应商处购得，比如GIBCO™ KnockOut™ Serum（由赛默飞世尔提供）。1 f5 Q5 A! T% P8 H7 F3 u. f/ b" ]
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血清“有能力维持细胞生长，但同时也有可能诱导它们分化，因此这里有一个平衡，”Villa-Diaz解释道。他将这个比喻成在浑水中钓鱼，根本不知道往哪儿下钩子。“如果你有无异源成分、化学成分限定的条件，那么你清楚知道培养基和基质中的所有组分，这就好比在清水中钓鱼。无论你采用哪种处理，你都知道哪些变量会受到影响。”
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在这一方面，威斯康星大学的James Thomson起了很大的推动作用。他的实验室报告了一种名为TeSR的配方，在完全没有异源蛋白的情况下支持PSC的生长。不过“人血清白蛋白和人源基质蛋白的加入让这些条件的成本过高，不利于常规使用，也不是真正的完全限定，”他的研究小组这样描述TeSR。如今这个配方经过一些修改，已经商业化，它就是Essential 8培养基（E8）。
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3 e2 z2 c. u2 m6 s$ dThomson的研究小组采用一种艰难的组合方式来创建E8培养基，将TeSR的18种成分缩减到8种，在加入DMEM/F12基础培养基之后，可与TeSR一样支持干细胞的生长。“一个主要的改进是省去了血清白蛋白成分，因为无论是动物还是人源的白蛋白都存在批间差，这一直困扰着人类ES和iPS细胞培养，”他们写道。! I, e: B1 X, B" X. N  ]

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与小鼠干细胞不同，不与其他细胞接触的人类多能干细胞将很快开始经历失巢凋亡（anoikis），这是程序性细胞死亡的一种形式。这不仅在传代和培养细胞时出现，也在冷冻、解冻和分选细胞时出现。因此，细胞通常以团块形式传代，或用抗凋亡剂处理，如Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂。3 H" z: e7 V5 x1 T# w. u% ?) W( R) D1 A

6 \' I  g8 I8 O0 R" B; z. u: T不过，NIH干细胞部门的研究人员Kevin Chen指出，ROCK抑制剂是强效的药物，可能对培养有一些副作用，长期影响尚未经过评估。Chen及其同事正在研究其他的方法，包括采用各种基质来模拟与邻近细胞的接触，希望能绕过ROCK抑制剂。Chen不倾向于培养细胞群落，而是支持非群落的单层培养。他觉得这样更容易操作，产量也更高。
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人们也有意采取悬浮培养的方式扩大PSC的培养。为此，STEMCELL Technologies很快将推出mTeSR3D，这经过改造和优化，适合补料分批操作。据介绍，从6孔板开始，这种培养基可在两周内使细胞个数达到109。  y" H' E. u% G* e
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如今，越来越多的工具可用于多能干细胞的培养，从解离和冻存试剂到多能性标志物的检测试剂盒。同时，科研、临床和制药实验室也在不断开发新的操作，希望能快速推动这个领域的发展。