求助：RT-PCR protocol

have-a-rest

谁有现成的RT-PCR的protocol分享一下，谢谢！

smy124920

那个RNA浓度检测后，逆转录所需要的RNA质量每组要相同，10ul的体系不要超过500ng。
5 m/ N2 h( ]/ r' }! [纯度要看OD260\OD280，看的是蛋白质等有机物质的污染，数值最好在1.8-2。2之间，A260看的是盐离子浓度吧

flydayzhu

一步法RT-PCR4 W- {* p2 b( b
１：反转录反应$ H; e; X3 s0 E
按下表准备反应液
8 E* R) ^& U/ |( ?  P- U样品 体积 终浓度
/ T, D) q' H0 W4 p５×反应缓冲液 10μl １×
+ Q/ J6 V8 f' k# w: y" w$ hdNTP混合液 1μl 0.2mM
! ~; L: U, J4 d' g+ z下游引物 50pmol* 1μm
0 n" y* O2 q& d* ~/ j上游引物 50pmol* 1μm
' s9 @' e! K5 X8 Z% S! I. T25mM MgSO4 2μL 1mM
& V6 F8 h7 ?( Q- [6 H$ BAMV反转录酶 1μl 0.1μ/μl( ]) H8 w) Q' P1 ]
TflDNA聚合酶 1μl 0.1μ/μl
/ n9 D0 L9 @+ l0 K4 y( F) RRNA模板 xμl**$ M1 t. n1 h3 E" G9 T0 y0 t% s+ C# B
去核酶无菌水 加至５０μl& {' B( @) R6 h
２：滴加１－２滴去核酶的矿物油
7 _7 h7 S; q: w' e5 l* S; h３：在控温水浴或其它设备中48℃保温４５分钟
9 S( e+ a0 b( C' v: O2 c! ?0 D0 _# ]４：设定PCR参数，PCR循环以合成cDNA第二链及扩增
+ h' e3 @1 H6 o# ~7 u５：RT-PCR产物分析
: k0 Y/ W* B2 z# ]$ d反应产物上１％的琼脂糖凝胶电泳分析结果，对于对照样品，扩增条带为323bp。
. O) ?$ g( n! i, t６：扩增产物在－20℃保存。) u( w3 b# n8 C3 f9 Q
注1：引物，５０pmol＝16.3ng×b,b:引物碱基数。对于对照样品上下游引物钧取3.3μl；模板，用103－106拷贝量的模板，或1pg-1μg总RNA，对于对照反应，选用对照模板量为2μl(106拷贝量)( x. ?) g. H2 C- P; g) X# x5 q
2：RT-PCR能否有效地进行,依赖于模板mRNA的完整性和纯度。在操作中必须具备一个无RNA-酶的环境,实验过程中应该用消毒的离心管、吸液头,戴手套,用DEPC处理的水。如果要从核酸酶活性高的样品中分离RNA时,建议使用RNA酶抑制剂。

rainsky1314

真核细胞RNA 提取及RT-PCR
5 v, M1 x0 Z! e9 ?+ u, Z第一部分：RNA 提取（以六孔板为例）
: Z2 u; ]# ?9 Q5 X1、        收细胞：将转染或因子处理后的细胞用胰酶消化后，PBS洗三遍，弃上清。9 M) {5 Z6 z/ n+ _: y
2、        裂解：每管样品中加1mL Trizol，室稳放置15-20分钟至液体澄清。
- p3 a- X$ p$ N: w0 f( U( m3、        萃取：每管加0.2 mL 氯仿，震荡混匀（使用震荡器震荡，直至样品呈现粉白色浑浊均匀的液体），室温放置2-3分钟。（可见分层，上层为白色下层为粉红色）4℃，12000rpm,10min.
2 G: D8 |1 n3 w4、        取离心后的上清置于另一RNA专用EP管（不要取到分层处）。* V& f4 \: J$ @' I
5、        抽提：在以上体系中加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后，室温放置10分钟。4℃，12000rpm,10min，去上清，沉淀为白色片状产物。- \. v* S! ^9 m4 m5 G. r
6、        漂洗：每管用0.5mL75%乙醇（DEPC水配成）洗两遍，每次4℃，12000rpm,5min.最后一次空离3-5min,彻底去除乙醇。细胞台中风干1h.
7 t5 k. g5 b! B% T/ q6 e7、        洗脱：每管用25-30 uLDEPC水重悬RNA，立即用于cDNA合成或-70℃保存。2 A& H4 S  a' V$ }& D3 a

3 w: L' Z, a: s& l* o$ r) s
: ~) i; A  X6 R5 a4 ?7 G第二部分：RT-PCR$ z* Z4 k, g" Y
1、分光光度仪测RNA浓度和纯度，        取4ugRNA+2uL oligo(dT)+DEPC水（补至总体积17uL），70℃水浴5min,立即冰浴，冷却。
( M2 r4 {7 u0 l5 `& p) [/ F2、在上述RNA+oligo体系中加入：
0 }- \+ O+ j4 C4 B3 W7 k) k) X  5× Reaction buffer      5uL; N/ ]. j; I/ Q
10mMdNTP                1.5uL  F  M- s; G2 ]1 J( U! ^
rRNasin                 0.75uL
5 ?( Y. \8 u6 ~2 _M-MLVRT                 1.2uL
5 [% P* y: J; K3 N+ V: m终体系为25uL,42℃,60min得到反转录产物，可立即用于PCR或-20℃保存。$ a2 `2 x5 F7 M' y- J# W+ U4 F
注意事项：整个实验过程中严格按照RNA相关操作规程，勤更换PE手套，配戴口罩、帽子，使用RNA专用枪尖和试剂，全程尽量少说话，防止RNA酶污染。

rainsky1314

真核细胞RNA 提取及RT-PCR
) D' }# W2 s2 R2 M# Q: C3 j第一部分：RNA 提取（以六孔板为例）3 N; V% h# p! u& d2 a
1、        收细胞：将转染或因子处理后的细胞用胰酶消化后，PBS洗三遍，弃上清。: [" }$ _; a" P7 Q" ~$ h
2、        裂解：每管样品中加1mL Trizol，室稳放置15-20分钟至液体澄清。
* P4 Q: u, ?7 N4 T3 {2 k3、        萃取：每管加0.2 mL 氯仿，震荡混匀（使用震荡器震荡，直至样品呈现粉白色浑浊均匀的液体），室温放置2-3分钟。（可见分层，上层为白色下层为粉红色）4℃，12000rpm,10min.1 W* l* }* Y  X9 Z( d$ U* e  d
4、        取离心后的上清置于另一RNA专用EP管（不要取到分层处）。& y# J0 R. y8 g  o( Y5 O
5、        抽提：在以上体系中加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后，室温放置10分钟。4℃，12000rpm,10min，去上清，沉淀为白色片状产物。( F  C* O" g+ u( R4 r  E, ~
6、        漂洗：每管用0.5mL75%乙醇（DEPC水配成）洗两遍，每次4℃，12000rpm,5min.最后一次空离3-5min,彻底去除乙醇。细胞台中风干1h.  \4 B: {( g+ n: u( {# |
7、        洗脱：每管用25-30 uLDEPC水重悬RNA，立即用于cDNA合成或-70℃保存。
: o! c  g' A' `
+ }( W( T2 g8 Z: X1 B: p0 o6 o. k& ~$ P
第二部分：RT-PCR
6 ^5 ]' ~. K3 R( L1、分光光度仪测RNA浓度和纯度，        取4ugRNA+2uL oligo(dT)+DEPC水（补至总体积17uL），70℃水浴5min,立即冰浴，冷却。# V/ `! }( D% ^* l1 L. M
2、在上述RNA+oligo体系中加入：
3 l  y0 n+ C8 b4 @; u  5× Reaction buffer      5uL
" j- o0 I: ?8 E& e3 S 10mMdNTP                1.5uL
$ p6 U8 S3 w& NrRNasin                 0.75uL
7 |8 j$ E* h3 t+ R: K8 sM-MLVRT                 1.2uL( P3 ?1 o* K9 X3 r! C
终体系为25uL,42℃,60min得到反转录产物，可立即用于PCR或-20℃保存。
5 p! K" P1 K3 P2 W+ J; E/ E注意事项：整个实验过程中严格按照RNA相关操作规程，勤更换PE手套，配戴口罩、帽子，使用RNA专用枪尖和试剂，全程尽量少说话，防止RNA酶污染。

hjqincc

看来比较详细啊呵

hualin840518

zpzp0312

谢谢！~~~

have-a-rest

我找到一个可以参考的，适合刚开始操作时参考。

masion

xiexie!