求助：RT-PCR protocol

have-a-rest

谁有现成的RT-PCR的protocol分享一下，谢谢！

细胞海洋

2009-6-30 19:04 上传

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- G+ F- A& b; f  T8 u
! [" {, [. C$ k0 q6 q8 Q是不是这本书
4 R. P/ o3 S* X' b  N7 p) \6 Z# u4 S% D4 }
rt-pcr_protocols.rar (4.14 MB)

2009-6-30 19:04 上传

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have-a-rest

感谢！
- R  q5 \7 B8 u实际操作中应该有一个简单的操作步骤。我指常用的半定量rt-pcr。

masion

xiexie!

have-a-rest

我找到一个可以参考的，适合刚开始操作时参考。

zpzp0312

谢谢！~~~

hualin840518

hjqincc

看来比较详细啊呵

rainsky1314

真核细胞RNA 提取及RT-PCR
6 @. z- d7 Z$ M* J0 f' q; S第一部分：RNA 提取（以六孔板为例）- }1 j! ~6 x* J; F
1、        收细胞：将转染或因子处理后的细胞用胰酶消化后，PBS洗三遍，弃上清。6 Z+ c7 Q7 s/ f$ e. w& o
2、        裂解：每管样品中加1mL Trizol，室稳放置15-20分钟至液体澄清。
4 m* W1 m2 `2 X3 `% m7 D3、        萃取：每管加0.2 mL 氯仿，震荡混匀（使用震荡器震荡，直至样品呈现粉白色浑浊均匀的液体），室温放置2-3分钟。（可见分层，上层为白色下层为粉红色）4℃，12000rpm,10min.
4 R6 ]& d4 \8 b; A0 s4、        取离心后的上清置于另一RNA专用EP管（不要取到分层处）。
' r4 ^  I# N$ D  @5 N5 d* v+ [5、        抽提：在以上体系中加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后，室温放置10分钟。4℃，12000rpm,10min，去上清，沉淀为白色片状产物。
5 P4 q0 r7 q+ F1 d4 B6、        漂洗：每管用0.5mL75%乙醇（DEPC水配成）洗两遍，每次4℃，12000rpm,5min.最后一次空离3-5min,彻底去除乙醇。细胞台中风干1h.# K; ^# Y% Y) N& U/ z. h( D
7、        洗脱：每管用25-30 uLDEPC水重悬RNA，立即用于cDNA合成或-70℃保存。
) r7 q8 |1 Y9 A
1 @0 u8 L4 H* Z2 U, W2 j8 k( U9 `. c  _6 G& y& Z
第二部分：RT-PCR7 S9 V1 K- f# x1 i
1、分光光度仪测RNA浓度和纯度，        取4ugRNA+2uL oligo(dT)+DEPC水（补至总体积17uL），70℃水浴5min,立即冰浴，冷却。
9 g, F3 ^. r% L/ w2、在上述RNA+oligo体系中加入：% i1 b# Q# m3 b5 z0 v' O6 ~& a
  5× Reaction buffer      5uL
" U2 X% I; Q$ x& z/ c; ^ 10mMdNTP                1.5uL  X+ ~; \5 @# X6 P  }- p
rRNasin                 0.75uL5 \: G7 o9 C) c) V8 q9 Q2 k
M-MLVRT                 1.2uL
9 m) d2 `; N# X$ Y终体系为25uL,42℃,60min得到反转录产物，可立即用于PCR或-20℃保存。$ G! {' W4 ^' w
注意事项：整个实验过程中严格按照RNA相关操作规程，勤更换PE手套，配戴口罩、帽子，使用RNA专用枪尖和试剂，全程尽量少说话，防止RNA酶污染。

rainsky1314

真核细胞RNA 提取及RT-PCR. a# y8 M* D4 L' \$ s
第一部分：RNA 提取（以六孔板为例）
# M1 K0 e- ]' N# s( c1、        收细胞：将转染或因子处理后的细胞用胰酶消化后，PBS洗三遍，弃上清。
& o, L! C% x: _* M+ W& W) r. u2、        裂解：每管样品中加1mL Trizol，室稳放置15-20分钟至液体澄清。
, ~9 f$ z  g7 S/ V3 y; n: V3、        萃取：每管加0.2 mL 氯仿，震荡混匀（使用震荡器震荡，直至样品呈现粉白色浑浊均匀的液体），室温放置2-3分钟。（可见分层，上层为白色下层为粉红色）4℃，12000rpm,10min., g/ L% }# Z; G- Y0 |6 M$ ^+ V
4、        取离心后的上清置于另一RNA专用EP管（不要取到分层处）。
; j1 X/ h: j; W0 ]' D6 \8 w5、        抽提：在以上体系中加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后，室温放置10分钟。4℃，12000rpm,10min，去上清，沉淀为白色片状产物。- ?- L) Y& e+ \. v
6、        漂洗：每管用0.5mL75%乙醇（DEPC水配成）洗两遍，每次4℃，12000rpm,5min.最后一次空离3-5min,彻底去除乙醇。细胞台中风干1h.
* E. b* g* t" m/ M5 v) D2 w, D7、        洗脱：每管用25-30 uLDEPC水重悬RNA，立即用于cDNA合成或-70℃保存。' \+ ]8 a& m  e; w

+ h6 W+ O% B$ j8 i6 O- @; [8 Y' T9 Y% S% I6 x- T2 o
第二部分：RT-PCR7 F5 H; b, P2 ~: a9 H$ m: v
1、分光光度仪测RNA浓度和纯度，        取4ugRNA+2uL oligo(dT)+DEPC水（补至总体积17uL），70℃水浴5min,立即冰浴，冷却。
# Q5 S, X  {0 t/ R: U8 ]2、在上述RNA+oligo体系中加入：. H8 z: S% G8 e) f+ V% v& Z( l  P
  5× Reaction buffer      5uL
( Y; Q! A: S8 r 10mMdNTP                1.5uL
7 ?  S: f. @' O$ N: u2 [rRNasin                 0.75uL
1 v: i& p5 N& x- o. g0 ~4 W' d8 ZM-MLVRT                 1.2uL
0 X1 c; F  j0 e! S) k6 X终体系为25uL,42℃,60min得到反转录产物，可立即用于PCR或-20℃保存。
" S# J7 {/ P  c注意事项：整个实验过程中严格按照RNA相关操作规程，勤更换PE手套，配戴口罩、帽子，使用RNA专用枪尖和试剂，全程尽量少说话，防止RNA酶污染。