外周血单个核细胞分离完有红细胞

lybai

我们的主要操作步骤：+ F% C% m3 x# C: O& G
1 10ml全血用10ml 1640培养基稀释，轻轻混匀
5 h8 \; a# B! \( p4 L9 A% w2 J2 稀释的血液20ml缓慢加到20ml淋巴细胞分离液（Gibico）上。1500rpm/min, 30min,
  [! L! \5 }0 z3 C" o3 |5 r3 吸取白膜层，然后1:1用PBS洗。2000rpm/min, 10min,
8 b# b4 z+ X' O  Z0 z4 弃上清，再次加20mlPBS，吹散细胞，2000rpm/min, 10min- H! u; H7 E/ T" U2 T% B
5 最后加2ml PBS,计数。
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9 W- R, c2 `( ?( K
$ ?8 H; d  W7 Z# K2 i# h, L7 U/ s细胞悬液离完心即可看到底部有明显的红色沉积，显微镜下也能看到红细胞，求教各位大神，
/ g8 u1 a  f, e1 O$ |1 我们第一次离心的时候，转速是不是有点低，我查了一下，我们的转速相当于400g离心力，其它有的人用800g,或2000rpm，我们也试过500g离心，离心完之后，细胞很难吹散。
7 F/ }# H  X  @, N' Y4 R) V2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是1:1，看别人用2:1~3:1,这个对试验影响大么？

niliu730323143

用得是什么牌子的离心机？

lybai

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7 |, c+ R. O0 S: H5 f
# Z' e( H: |: `: N用的湘仪的4 l% T& ~! s& n0 \0 v; {

niliu730323143

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  P% K, G: N0 Y& V
' {; `  x8 I0 l. m- N; @, _减速的时候离心机的振荡导致分层混乱了，建议用stemcell特制的分离管，这样就不用换离心机了。

lybai

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2 d* w( u5 g: P4 `! D
2 N* ?+ g( a' t& r+ _* ^我们离心的时候，减速设置的是0

lybai

回复 niliu730323143 的帖子, w, X, }1 `! z; e
. `( ?& ~1 d0 M/ E; i+ b' D
离心完成之后，分层还是很明显的，白膜层很清晰

niliu730323143

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4 K4 m' t) M8 b9 I- O我们也遇到这种情况，所以，信不信由你

lybai

回复 niliu730323143 的帖子. ~& }7 ]' \) w9 i$ {" X3 S: V3 }

" f9 v5 b+ a  ?5 L, J1 ~  L8 l谢谢您提供经验，我们到时候也试试

cellprobe

红细胞是在所难免的，可以加红细胞裂解液去除。如果不加红细胞裂解液，红细胞也会慢慢的自动破裂。

Diane0321

1 我也在分离单个核细胞，我的离心速度只有1800rpm，20min，加减速度为0，但是我的血样比较少，一般只有2-3ml，离心后有明显的白膜层，在此离心后也是有部分红细胞，所以我们一般都会按1：4加红细胞裂解液进去，室温作用5min，这样基本就没有红细胞了。
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: L3 W4 A0 A$ ?7 y, r. U% ~2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是2:1，也试过1：1，感觉没什么影响( G% A+ A3 ~' v! \% l2 w* S

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