外周血单个核细胞分离完有红细胞

lybai

我们的主要操作步骤：, K6 m2 k) A0 j7 f& r" v
1 10ml全血用10ml 1640培养基稀释，轻轻混匀- z/ M+ W2 `8 Q8 f; C8 g* O6 F* g
2 稀释的血液20ml缓慢加到20ml淋巴细胞分离液（Gibico）上。1500rpm/min, 30min,
8 m! S/ U9 I; K0 ?$ ~3 吸取白膜层，然后1:1用PBS洗。2000rpm/min, 10min,+ j) D; [% w8 Q, [$ I+ {" |4 F4 N
4 弃上清，再次加20mlPBS，吹散细胞，2000rpm/min, 10min8 C0 t. u: J0 E
5 最后加2ml PBS,计数。
% x# Z/ w' k4 a# C5 `' C$ | 0 j) F7 ~: \3 x! A) t5 b0 j
5 ^( b7 z  m/ a- r* ^
细胞悬液离完心即可看到底部有明显的红色沉积，显微镜下也能看到红细胞，求教各位大神，) M/ s; Z5 [8 d! A6 u/ n
1 我们第一次离心的时候，转速是不是有点低，我查了一下，我们的转速相当于400g离心力，其它有的人用800g,或2000rpm，我们也试过500g离心，离心完之后，细胞很难吹散。
' e5 S( `- K2 |2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是1:1，看别人用2:1~3:1,这个对试验影响大么？

niliu730323143

用得是什么牌子的离心机？

lybai

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' B' y& m7 H& f用的湘仪的
0 n% i) c% b7 j% e5 l* `7 U) C

niliu730323143

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, L! j3 R: i+ g: a4 A* b. C% u3 ?! Q" }. G
减速的时候离心机的振荡导致分层混乱了，建议用stemcell特制的分离管，这样就不用换离心机了。

lybai

回复 niliu730323143 的帖子* @4 u' y! }+ a! T
2 s; V" F$ ?! J% [) @: g' _) ~* J, i! `
我们离心的时候，减速设置的是0

lybai

回复 niliu730323143 的帖子7 Y6 k1 H9 {: k; L
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离心完成之后，分层还是很明显的，白膜层很清晰

niliu730323143

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5 r' C4 r* R8 O& y! ~% h/ ~+ a- N' o! B3 k6 G; s2 d
我们也遇到这种情况，所以，信不信由你

lybai

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  ?9 ?' B, f- `2 Y) i) S% J5 y
谢谢您提供经验，我们到时候也试试

cellprobe

红细胞是在所难免的，可以加红细胞裂解液去除。如果不加红细胞裂解液，红细胞也会慢慢的自动破裂。

Diane0321

1 我也在分离单个核细胞，我的离心速度只有1800rpm，20min，加减速度为0，但是我的血样比较少，一般只有2-3ml，离心后有明显的白膜层，在此离心后也是有部分红细胞，所以我们一般都会按1：4加红细胞裂解液进去，室温作用5min，这样基本就没有红细胞了。
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3 R" o3 h1 h/ Y2 B7 k$ E2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是2:1，也试过1：1，感觉没什么影响
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