外周血单个核细胞分离完有红细胞

lybai

我们的主要操作步骤：1 q. c( l# _& b. I( g) D$ D
1 10ml全血用10ml 1640培养基稀释，轻轻混匀# k: u) N. i, h: F) K
2 稀释的血液20ml缓慢加到20ml淋巴细胞分离液（Gibico）上。1500rpm/min, 30min,1 c! S. d( S) ^9 Y/ d
3 吸取白膜层，然后1:1用PBS洗。2000rpm/min, 10min,
1 U, h  E+ ~* c4 x! C' G+ n9 a1 |1 I4 弃上清，再次加20mlPBS，吹散细胞，2000rpm/min, 10min
+ f4 s, C/ r: z. q5 最后加2ml PBS,计数。5 I+ L+ A6 u/ x: F2 {) Q' {
7 `3 o# J3 O, z  M, y& b% P

5 M3 f0 l% P  J细胞悬液离完心即可看到底部有明显的红色沉积，显微镜下也能看到红细胞，求教各位大神，$ k/ E) y, Z: D7 Y
1 我们第一次离心的时候，转速是不是有点低，我查了一下，我们的转速相当于400g离心力，其它有的人用800g,或2000rpm，我们也试过500g离心，离心完之后，细胞很难吹散。
- v0 w- M4 I5 x4 }2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是1:1，看别人用2:1~3:1,这个对试验影响大么？

niliu730323143

用得是什么牌子的离心机？

lybai

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3 F# t; G/ h2 R; C4 @" C/ F' m, |' x9 I- }; L- w7 s
用的湘仪的7 ]3 c1 P- T& {! P( }

niliu730323143

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* h3 }: J4 f- Z3 @2 E$ p6 W( ]: {6 @
0 r: x# u: w) S# c$ D/ |0 _减速的时候离心机的振荡导致分层混乱了，建议用stemcell特制的分离管，这样就不用换离心机了。

lybai

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$ k3 L, Y4 `* m: o1 L+ z& x& p) J) A1 {% s$ L7 l  R  O; s
我们离心的时候，减速设置的是0

lybai

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; |- A# {5 F3 _! j9 @5 H
  I/ h2 m( p. `3 T离心完成之后，分层还是很明显的，白膜层很清晰

niliu730323143

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7 ?6 f7 |4 ^9 D" ]4 ?. C4 L6 c我们也遇到这种情况，所以，信不信由你

lybai

回复 niliu730323143 的帖子0 i1 |4 K' t0 o4 m

& |; g. M5 r" r谢谢您提供经验，我们到时候也试试

cellprobe

红细胞是在所难免的，可以加红细胞裂解液去除。如果不加红细胞裂解液，红细胞也会慢慢的自动破裂。

Diane0321

1 我也在分离单个核细胞，我的离心速度只有1800rpm，20min，加减速度为0，但是我的血样比较少，一般只有2-3ml，离心后有明显的白膜层，在此离心后也是有部分红细胞，所以我们一般都会按1：4加红细胞裂解液进去，室温作用5min，这样基本就没有红细胞了。
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+ g+ c2 P$ u7 o5 [9 U3 P6 I7 A2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是2:1，也试过1：1，感觉没什么影响! b% p/ u) y- ^; V) T! U+ `: g

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