外周血单个核细胞分离完有红细胞

lybai

我们的主要操作步骤：
" Y( r+ A' c0 _& O' p0 K2 ^0 D1 10ml全血用10ml 1640培养基稀释，轻轻混匀/ n/ G( v9 F2 x0 O9 c
2 稀释的血液20ml缓慢加到20ml淋巴细胞分离液（Gibico）上。1500rpm/min, 30min,/ c  R+ }% Y/ q
3 吸取白膜层，然后1:1用PBS洗。2000rpm/min, 10min,
8 t" p! b/ j2 E: a4 N4 弃上清，再次加20mlPBS，吹散细胞，2000rpm/min, 10min6 E( s  [: a" |$ n* o4 F$ e/ k( P
5 最后加2ml PBS,计数。7 {3 H+ A6 [9 L6 a! ~8 Z

3 n  w+ \  A2 J. v+ m6 k
" |; [( x7 ?$ k7 L' m细胞悬液离完心即可看到底部有明显的红色沉积，显微镜下也能看到红细胞，求教各位大神，9 `# J: V* c1 s" m. B4 D' y1 H1 m
1 我们第一次离心的时候，转速是不是有点低，我查了一下，我们的转速相当于400g离心力，其它有的人用800g,或2000rpm，我们也试过500g离心，离心完之后，细胞很难吹散。# H' H" d5 V$ P8 Y+ c4 L: w
2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是1:1，看别人用2:1~3:1,这个对试验影响大么？

niliu730323143

用得是什么牌子的离心机？

lybai

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  ^: v% M0 d* C# H' F; N0 M
- {* `; {, ?! O, J1 m" i用的湘仪的
# ~, M% B: h  E

niliu730323143

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& n6 Y0 z5 Z3 d9 [
减速的时候离心机的振荡导致分层混乱了，建议用stemcell特制的分离管，这样就不用换离心机了。

lybai

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; H! u3 c& }( f) L$ g0 j
9 f, H. g8 Q  ~+ n我们离心的时候，减速设置的是0

lybai

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, S2 M  Q3 O# ]4 f; G* C
" a* H, h! `4 l, }2 }离心完成之后，分层还是很明显的，白膜层很清晰

niliu730323143

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我们也遇到这种情况，所以，信不信由你

lybai

回复 niliu730323143 的帖子" G' j! N2 @9 F0 z
' A- Y" G. X, ~; t  l$ B
谢谢您提供经验，我们到时候也试试

cellprobe

红细胞是在所难免的，可以加红细胞裂解液去除。如果不加红细胞裂解液，红细胞也会慢慢的自动破裂。

Diane0321

1 我也在分离单个核细胞，我的离心速度只有1800rpm，20min，加减速度为0，但是我的血样比较少，一般只有2-3ml，离心后有明显的白膜层，在此离心后也是有部分红细胞，所以我们一般都会按1：4加红细胞裂解液进去，室温作用5min，这样基本就没有红细胞了。
1 d, P7 T) e3 h4 k# {1 X
: o3 }2 I- G- Q2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是2:1，也试过1：1，感觉没什么影响; L. v! t$ f6 N8 r8 d
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