外周血单个核细胞分离完有红细胞

lybai

我们的主要操作步骤：3 ], d; f: N4 N6 c1 Q0 U
1 10ml全血用10ml 1640培养基稀释，轻轻混匀$ z4 K) U- l9 @' Z& I- T
2 稀释的血液20ml缓慢加到20ml淋巴细胞分离液（Gibico）上。1500rpm/min, 30min,6 f. J& l, o1 `$ |+ I
3 吸取白膜层，然后1:1用PBS洗。2000rpm/min, 10min,
. y0 z$ Z+ N( a' \3 e4 弃上清，再次加20mlPBS，吹散细胞，2000rpm/min, 10min( l& k: q1 p  u! x
5 最后加2ml PBS,计数。, G) g# S& c% d# j5 _

$ L4 v( ?; e; I+ C0 c5 n+ m+ `; `* ?; t3 {% I" a6 [
细胞悬液离完心即可看到底部有明显的红色沉积，显微镜下也能看到红细胞，求教各位大神，
) {# `- E4 a9 K$ B9 |7 W2 L2 k1 我们第一次离心的时候，转速是不是有点低，我查了一下，我们的转速相当于400g离心力，其它有的人用800g,或2000rpm，我们也试过500g离心，离心完之后，细胞很难吹散。
# C' Z# a+ m6 ^( B2 U' c; M2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是1:1，看别人用2:1~3:1,这个对试验影响大么？

niliu730323143

用得是什么牌子的离心机？

lybai

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$ a' u8 n( W$ f. E7 T5 u' c: H* U& x; [3 L" [1 W2 @7 {
用的湘仪的
& L3 k& i6 j" C8 K2 Q0 y" y7 s9 z

niliu730323143

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0 a+ P7 c) O' R; c: n! R( W. K2 M: S- d+ y  a; e  w* Q
减速的时候离心机的振荡导致分层混乱了，建议用stemcell特制的分离管，这样就不用换离心机了。

lybai

回复 niliu730323143 的帖子# a% J+ u; h0 b. f' i" u( F# v
  D5 x6 |6 W/ p" S' S+ |
我们离心的时候，减速设置的是0

lybai

回复 niliu730323143 的帖子2 a: }8 w6 W! b' z$ ?  B5 G. c

' u( v( M! m: l, y6 @离心完成之后，分层还是很明显的，白膜层很清晰

niliu730323143

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* Z; n3 n. D, d! X7 q; Y4 N$ g  ~, r, |9 r6 z
我们也遇到这种情况，所以，信不信由你

lybai

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8 `% U! {5 _5 A  y' ?谢谢您提供经验，我们到时候也试试

cellprobe

红细胞是在所难免的，可以加红细胞裂解液去除。如果不加红细胞裂解液，红细胞也会慢慢的自动破裂。

Diane0321

1 我也在分离单个核细胞，我的离心速度只有1800rpm，20min，加减速度为0，但是我的血样比较少，一般只有2-3ml，离心后有明显的白膜层，在此离心后也是有部分红细胞，所以我们一般都会按1：4加红细胞裂解液进去，室温作用5min，这样基本就没有红细胞了。
0 }) L, K9 h+ S3 X9 c# @8 N
7 J; U" [7 i. L1 ]$ {2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是2:1，也试过1：1，感觉没什么影响
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