外周血单个核细胞分离完有红细胞

lybai

我们的主要操作步骤：
! c) h4 h- g# m1 10ml全血用10ml 1640培养基稀释，轻轻混匀. K8 n' r  y# y. J7 ]+ N
2 稀释的血液20ml缓慢加到20ml淋巴细胞分离液（Gibico）上。1500rpm/min, 30min,
, L5 r  J; C. t8 [3 吸取白膜层，然后1:1用PBS洗。2000rpm/min, 10min,
& F3 ?2 m* Q* o" U5 k# y: z# d4 弃上清，再次加20mlPBS，吹散细胞，2000rpm/min, 10min
. \$ V: |, b! J; g5 最后加2ml PBS,计数。6 J$ j& r" [! t
5 P" ~9 [7 a; L: t0 L

$ z) y6 ~3 A- a1 R" I" O. A! g细胞悬液离完心即可看到底部有明显的红色沉积，显微镜下也能看到红细胞，求教各位大神，2 s  q; y3 r! Z* `3 F% q: b0 X
1 我们第一次离心的时候，转速是不是有点低，我查了一下，我们的转速相当于400g离心力，其它有的人用800g,或2000rpm，我们也试过500g离心，离心完之后，细胞很难吹散。
8 L9 E: B$ P: ~: z5 s# f2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是1:1，看别人用2:1~3:1,这个对试验影响大么？

niliu730323143

用得是什么牌子的离心机？

lybai

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3 n0 J/ F8 W1 c4 P& J+ I" G" M5 Q& A/ i  k6 s% M7 Q
用的湘仪的
- h& H  F+ R, O* k$ Q9 m6 S

niliu730323143

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( ~. V7 P+ O% \9 r) r: C. O减速的时候离心机的振荡导致分层混乱了，建议用stemcell特制的分离管，这样就不用换离心机了。

lybai

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. W9 C+ C' i9 I; o5 w  Q6 ]2 Z9 Q
% Z/ }% i8 P' `9 g我们离心的时候，减速设置的是0

lybai

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, o: s% z6 G/ P# q! Z; l3 ?8 \( e2 E8 g4 u' @8 t
离心完成之后，分层还是很明显的，白膜层很清晰

niliu730323143

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. y4 s' H* n; q, \8 x" f' @" o1 F0 e我们也遇到这种情况，所以，信不信由你

lybai

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2 n$ ~+ |* K, Y- V0 l& T% Y" A, m+ ]谢谢您提供经验，我们到时候也试试

cellprobe

红细胞是在所难免的，可以加红细胞裂解液去除。如果不加红细胞裂解液，红细胞也会慢慢的自动破裂。

Diane0321

1 我也在分离单个核细胞，我的离心速度只有1800rpm，20min，加减速度为0，但是我的血样比较少，一般只有2-3ml，离心后有明显的白膜层，在此离心后也是有部分红细胞，所以我们一般都会按1：4加红细胞裂解液进去，室温作用5min，这样基本就没有红细胞了。5 x$ C7 R: l0 v2 ~
7 ?. ^# Q5 H6 Y9 U$ [9 A8 U% u) C
2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是2:1，也试过1：1，感觉没什么影响
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