求指教：PBMC分离完有红细胞

lybai

. P. D% j" l& f9 x1 Y; @我们的主要操作步骤：0 E* M, s4 c% U8 b# w. U, e6 f6 ~1 F
1 10ml全血用10ml 1640培养基稀释，轻轻混匀8 o0 p3 x2 m6 J# |% \2 |4 ~9 d
2 稀释的血液20ml缓慢加到20ml淋巴细胞分离液（Gibico）上。1500rpm/min, 30min,- y- s' C( X& x" ]! k/ j, [
3 吸取白膜层，然后1:1用PBS洗。2000rpm/min, 10min,3 L. O+ [/ e0 X( P/ p
4 弃上清，再次加20mlPBS，吹散细胞，2000rpm/min, 10min/ ?4 Y4 @, ~( J' R/ S
5 最后加2ml PBS,计数。9 F$ m& w- F3 @, [& `- Q! A& z
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细胞悬液离完心即可看到底部有明显的红色沉积，显微镜下也能看到红细胞，求教各位大神，
5 ]: C% L# h0 _2 ]$ c- t1 我们第一次离心的时候，转速是不是有点低，我查了一下，我们的转速相当于400g离心力，其它有的人用800g,或2000rpm，我们也试过500g离心，离心完之后，细胞很难吹散。
0 b8 V8 }) I! s7 d2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是1:1，看别人用2:1~3:1,这个对试验影响大么？

MCARS

血液和淋巴细胞分离液的比例影响不大，我们一般都是用50ml离心管加15ml分离液再加血液离心，有说法是血液中有未成熟的有核红细胞，密度和单个核细胞相似，由于密度梯度离心方法的局限性是没有办法完全去除的

金鹏

我也有楼主的疑问，有人的外周血分PBMC特别明显，细胞沉淀中有较多红细胞，有人的又不是很明显，这种差异是怎么产生的？有没什么好的方法从根本上高效分离PBMC，求大神赐教！

shy-shen

沉淀中有适当的红细胞是正常的，培养几天就没有了，现在市面上有红细胞裂解素，但效果真心不怎么样，你的离心力可以提高一下，吸取白膜层后上下颠倒混匀，洗两次效果会很好

天龙八部

离心的时候设置升速和降速为0

ltickp

升速降速调为 5，3  2000rpm/min
+ l. ~* _1 g; J& T或者后期裂解液破红，4摄氏度破红5min破红效果蛮好的
* Z- E  e/ b' _如果调整了操作还出现的话还有一个可能是血液本身个体差异的问题（放久了等等原因）

剡溪兰客

红细胞不影响生长，没事的

免疫与细胞

PBMC分离之后有红细胞很正常，不能完全分离，如果太多，那就多练习，与人为作业关系比较大。实在不行，可以用红细胞裂解液，但是要注意裂解时间，并需要洗净。

剡溪兰客

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, k7 B' X# p4 P# P% b+ U6 D5 E3 s* q. }9 v# O" H/ U6 i  o
用裂解液会影响细胞质量吧，导致培养增殖不佳。可以控制吗？/ \: P( X' x! E1 _) O

免疫与细胞

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' i+ F6 Q" s5 A8 d; Q( \# o. W5 B. ?) G: Q* J# w$ a+ ?, I
使用裂解液就要注意裂解时间，要及时终止，并清洗干净。它的影响就是，裂解时间长会对除红细胞以外的细胞产生伤害