胰酶消化后传代的人MSC常有大量死亡，怎么办？

咖啡壶

生长良好的人MSC经胰酶消化，吹打后传代，常有大量死亡，表现为细胞不贴壁，尤在24孔板中明显。请问高手问题出在哪？谢谢赐教!!!!!

dongzi

可能有以下几方面的原因：
/ w& ?, S! Q. K0 V. y6 L1.消化过度，可以适当减少消化时间，细胞皱缩到一定程度就可以终止，不一定要等到变圆甚至完全脱落下来，具体程度要自己把握- J7 m% n& b: j) O
2.如果胰酶0.25％浓度大不好控制时间，可以改用0.125％（加入等量D-HANKS即可,不必重新配）2 O/ U* R! u; n5 _% S7 D% y0 d% K
3.吹打时尽量减少泡沫产生，泡沫的表明张力对细胞影响也较大+ M. R2 ~; y# F2 P& R
4.如果传到玻璃瓶中要洗干净些/ t, ?- K, s3 [( K$ h
5.对数期传代，90％铺满就可，别长的太满了, {- [; T' }$ [8 q! v) P7 n* {
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希望对你有帮助

ccie

原因可能有几方面:2 `- O* x; A  D( ^* S9 y' A
1、胰酶消化的程度过大，原本生长状况良好说明你的培养条件是合适的，在消化时，细胞原本是连在一起的，待镜下看到细胞之间有了空隙时基本上可以用血清终止反应了。
7 H0 w7 h) [1 K2、吹打前不要忘记终止反应，不然就无形中延长了消化时间。
' r8 h3 j4 _* F1 b# ?9 b( [3、如果只是单纯的24孔板生长状况差，可以考虑明胶铺一下板，增加细胞的黏着力。

ccie

我一开始也是消化的不好，后来发现两点：
$ C% l6 A- m; K: v/ _: k8 r1、细胞铺满瓶底80－90％就可以了，长的太满消化时间长，而且不易消化成单个细胞悬液。0 I+ X. \$ f! m5 f$ q4 X
2、用0.25％胰酶加等量的0.2%EDTA，可减少胰酶对细胞的伤害。

lunde

我的一点经验，呵呵，仅供参考：
& R+ g, B; |: [7 [1.消化时间：即使根据经验，也一定要镜下观察，细胞有部分变圆就赶紧翻转培养瓶，使胰酶不再继续接触细胞！然后加含血清的培养基终止反应，再吹打。+ x! e* Y8 x. X1 ~, B3 |+ V" T
2.消化液：胰酶：0.25％或0.125％，我的经验最好不用EDTA，EDTA本身对细胞伤害作用也较大，我们做VSMC经验是，如果只用0.25％胰酶3分钟，如果加EDTA就一定要控制在1分钟之内操作完成即终止消化，而且用后最好要清洗离心去除残余EDTA。
& ~4 c2 i; b) g3.贴壁：传代的玻璃瓶或盖玻片可以涂点黏附剂，比如多赖、FN或者鼠尾胶等。
0 Q  B% B! v* }9 E% l" O+ F2 @9 B4.传代时间：90％融合，长的太满既不好消化，又难吹打为单细胞悬液，吹打时间过长或者硬吹打都会对细胞造成损伤。

lunde

我培养BMSC最近的经验：2 {5 Q7 d. U6 `
1传代时间：90％融合，长的太满不好消化，吹打时间过长或者硬吹打都会对细胞造成损伤。 2 o1 H% x! J6 T( N
2消化液：胰酶：0.25％或0.125％，用不用EDTA损伤细胞关系不是很大，因为我们用的胰酶量很少。
0 j, R2 `# A" |9 i% D" B- p3消化液的量及时间：我的经验是试验室温度高时（20度以上）用吸管滴6滴即可，不停的轻轻翻转培养瓶使胰酶不停冲刷底壁，一般1.5分钟即可。试验室温度低时，可以用1ml（大约15滴），放在培养箱里温育2－3分钟即可。以上开始试验室不好掌握，可以借助倒置显微镜观察。
8 s. D" w/ ^( E4然后加含血清的培养基终止反应，再吹打。我的经验中和要多一些培养基，不一定要2倍。吹打要轻，次数要少，一般7－8次即可。
* E, G& p/ p* G3 ], r6 g+ Z4.我的经验这么少的胰酶不用离心，直接加培养基传代即可。
8 P$ j! e4 O) u  o! \5传代：一般可以1传2。; K; ^9 N6 b( M! e0 r. `  _/ U# i
个人经验，仅供参考。

BOY555

我的经验：& r( m3 }4 g+ \7 T) T
1.传代时间：和楼上众人一样，不能长的太满才消化，最好是90％时。" V! K; u2 Y$ n3 Q4 N$ r* h
2.消化时间：因为你是24孔板，不易直接观察，镜下观察最好，且不能像培养瓶可以倒置，所以细胞开始回缩时有部分变圆时就回超净台加含血清的培养基终止反应，然后在孵箱中孵育2分钟。
& w* B* O: U. x# P3.胰酶：我们原来用0.25％胰酶－0.02％EDTA，发现消化过快，时间不易掌握，现在都改用0.125％胰酶－0.02％EDTA。24孔板每孔加0.5ml为佳。另新配制的胰酶消化较快，需要注意，以免动作太慢丢失细胞。
; `' R5 g6 p: z4.吹打：加入完全培养基后吹打也很关键，吹打力度一定要轻柔，时间也不易过长，且不能产生气泡。大概加入1ml培养基（1传2时）。使用移液管吹打时注意不要将移液管内液体排空，且管头不要离开液面，这样就不会产生气泡了。) v1 W4 J1 F& s3 R" b: j% T
5.另24孔板传代一般也是传致24孔板中为多，细胞在塑料制品中较易贴壁，所以一般无需加入其它物质促进其贴壁。但如果你用的是旧24孔板重复利用的话，担心贴壁不好可以先用0.1％明胶处理（每孔加入抽虑无菌的0.1％明胶盖满孔底，常温2－3小时后吸去多余明胶后，晾干并用无菌生理盐水冲洗一遍即可）。

BOY555

简单言之：
1 l# u- a" `# `2 w# o3 f, w& r2 X　　　　消化时间不能过长，吹打不要过于猛烈，温度是一关键因素，加量　　　　有关消化时间，生长不要过于集中（融合过多），代次也是影响因　　　　素，酶的浓度随时间改变，新酶效果肯定突出，ＥＤＴＡ催化迅速

askage

可能是细胞类型不同吧，我做的HUCMSC，感觉这细胞贴的很牢，0.25%的胰酶消化20分钟，都还不能完全消化下来

jinyiran

回复 9# askage * D, j1 }0 I; V$ K

3 p$ h  o! P7 z, S$ R( O) P( `& c9 w% y0 u% [3 J
    0.25%的胰酶你消化20分钟后,再种时,细胞还能贴壁吗~?~