骨髓间质干细胞分离培养纯化经验交流!!

无敌金刚

人骨髓基质干细胞的鉴定：' |. V1 k  \+ b+ R( U8 J, v% b& d
形态学特征 纺锤形细胞
1 R* D* Z9 k  L6 J2 d细胞组织化学特征 碱性磷酸酶弱阳性 糖原染色强阳性 a-醋酸萘脂酶阳性 过氧化酶阳性 I型胶原表达阳性+ m% A) K3 g+ L5 N( U
细胞表面特征：阳性：CD 44 50 54 56 58 102 106 166 5 X1 j, l, d& f% _
阴性：CD 3 4 5 14 15 34 45 HLA-DR等等

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书上说培养用低糖的DMEM,楼上说成骨诱导要用高糖的DMEM,难道向成骨诱导要改用高糖的DMEM？另细胞表面抗体检测全套抗体购买太贵，不知哪里可帮做呢

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不错 的确要换 7 y8 G/ L! n( u
详见 杨志明《组织工程》P126－129# y! Y/ f1 D: i& j! R
抗体检测就要看不同的分子生化实验室购买的抗体情况了
; D6 V' p2 c1 I& K8 g不过上面的多数比较常规 大型生化室应该有

无敌金刚

谢谢主任，直接早期贴壁分离纯化是很实用的，但是否有将这样处理的细胞作过表面标志测定呢，那样似乎更能说明该方法的优越。

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再谈谈个人的一些经验:
4 k' R( L% ^7 u1 在用等密度梯度离心法分离MSC时,一般取白膜样界面层细胞(单核细胞层)即可获得MSC, 其实在接近界面层的上层细胞(约1-2mm)仍然可以获得MSC,只不过相对较少而已;而在接近界面层的下层细胞就很难获得MSC了.这样,如果不想多做原代的战友就可以使用这种方法,多取些接近界面层的上层细胞进行培养./ n+ E# a0 u6 c$ s+ B
2关于兔MSC的获取:
+ m4 d, `$ Y: N0 \' e; V) B+ U将新生日本大耳兔(10d左右)断颈处死，75%乙醇浸泡5min，无菌条件下取四肢长骨，在D-Hanks平衡盐溶液中清除骨表面的软组织及骨膜，去除骨骺，用α－MEM培养液清洗骨干部2次， 然后在α-MEM全培养液（含15%胎牛血清，青霉素100U／ml，链霉素100μg/ml，25mM HEPES，pH7.0～7.2）内，将骨干纵行刨开，轻刮骨髓腔至颜色变白，用尖吸管(5ml空针、25号针头)吸取培养液反复冲洗骨髓腔面，收集冲洗液，用细胞筛网过滤，去掉骨碎片， 1000rpm离心5min，沉淀物加10ml培养液悬浮，血细胞计数器计数，使悬液含细胞数为1×107个／ml接种,孵育80分钟后第一次换液,轻轻冲洗未贴壁细胞;以后每2-3天换液,7天后可以传代,2代以后细胞即可纯化.这样获得兔MSC细胞增殖分化能力都较好,可以传30多代,仍然保持干细胞特性1 Q7 l) Z0 S/ m- R: d3 r
3 关于山羊MSC的获取:采用Percoll离心,2400rpm,30min的效果最佳.