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马上要开始做培养细胞试验了，作为一个新手，得从零开始，在园子里逛了一圈，长了不少见识，想想可能有和自己一样的新手需要帮助，就把自己的收集到的资料和以后做试验的经验过程逐期贴出。希望对向我一样的入门级战友一些帮助。
* w+ M& R, Y) R* d" @* F本贴为第一集——无菌要求
1 V: n6 I3 r7 X' g% c+ A无菌，是一个贯穿了我们整个医学生涯的概念，从第一天穿上白大褂时起，无菌的概念就逐渐成为我们的生活的一部分，直至成为一种潜意识的习惯，一种自觉行为。对于细胞培养来说，无菌要求更加严格和重要。闲话少说，进入正题吧。（本贴主要引用中国生命科学论坛，由于主要为基本原则，故引用为主） p) B- `, `4 z) p2 H4 |& o4 t
无菌室的灭菌：
, _# E* x. H7 z3 A& {1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。 7 A) y1 x/ p0 y- O2 t
2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射5 ^5 t( o+ Q/ @" T! o; F
3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟
# t$ F1 Z: ]0 W4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。
" O4 i& U0 l) W9 l- Z" T实验人员的无菌准备：
' D2 N: ]. b' E1.肥皂洗手。! M. T, l6 g: c4 i* D' Q! N
2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋
' V0 o; N$ J% l" F; }, U' y( `3.用75％酒精棉球擦净双手。
, j7 D9 s/ F% A+ D0 f无菌操作的演示： ; b' `( E) O/ `5 _9 j
1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面
5 k9 c9 t7 A/ ]$ ~( l/ s- c9 r' G2.靠近酒精灯火焰操作。3 r8 N7 u7 K; x5 b; c& O/ O& w
3.器皿使用前必须过火灭菌& B; ^" K' W8 t. {
4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。
" O& v$ F4 a1 p% n: {9 n U5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。& d0 l/ t9 t4 v8 ^/ i
6.吸取两器械的清洗和消毒 ! h( d" ], ~* H% h1 h. n' u
玻璃器械洗消： ! k; H) W6 g9 c$ p/ S0 j+ w
一、新的玻璃器皿的洗消： % L- x6 Q" u3 }% Q* K2 Q
1.自来水刷洗，除去灰尘。
2 c; i: n5 L" `; k2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。0 N& s' V/ j, y$ h" A' G- \8 s
3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。4 z, m5 l" X( `& a& M1 K; _
4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。3 Q3 d' \" P8 Y4 G" H% V8 Y- m
5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。& q- l# Q- e. u2 V8 w- p g
6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。
; ?# ~; c+ x; X9 \" e7.高压消毒后烘干
3 G* ]" M" u5 B+ F; Q* Y+ ]3 P二、旧的玻璃器皿的洗消：
( n) j% c( T1 L2 C. h1．刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。
; o) i3 _; Q* E$ C, N7 L( o2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。
* V4 j. D1 s, a4 z9 [0 ]- }3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。
: h2 V O3 i! j. l: K$ P4 ]4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）0 u8 c7 p j) ]
5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。5 Q7 l* ~# B: w) Z, u1 }
金属器械洗消：
) S6 [6 J& q; g) k p3 z金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。4 ]# W8 f# P3 r1 x4 h4 e. ?& i
橡胶和塑料：
$ z6 H8 G! N1 f' F橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：
) u- T/ M/ R4 y' z1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。 8 [ K/ X; W. y+ C9 M
2. 胶塞烘干后用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
/ Q3 Q- s, ]" ~2 \- r" g: ^4 e3. 胶帽，离心管帽烘干后只能在2％氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
( K5 I2 F* Z5 z5 `! G5 M4. 胶头可用75％酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。 ; Q2 h# n2 B& f3 l) o
5.塑料培养瓶，培养板，冻存管：
- K, f4 o% W, f6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70％酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。 d! K2 B D5 G% e6 E; s3 M* r
为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻(CoC12•6H2o)2g，30％盐酸10m1，蒸馏水88m1。 ' q7 n" ^) ~+ ]- s/ f: p' A5 i
注意事项： % X* ]+ V5 F' g5 U# e/ o }2 p! U
1.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。 , [8 ?+ E0 p q" h- t, Q+ `
2.安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。 3 a2 `+ Z; I% |: p6 V% N# @6 v7 s
3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡：A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。 $ \5 {2 h5 N* z: D
. V8 s& ?( l9 Y* [- }, z* J9 s( N细胞培养用液的配制与消毒 ( g8 Y3 O% [8 W- d3 Q9 |3 Q
器材与试剂：
0 M# B5 R+ C: B9 n2 T9 R干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。
7 c1 C; N# l3 D ?# G. z' i具体步骤：
- m- D5 Y# ]/ c一. 水的制备： 0 _/ ?3 ~7 _0 q" C7 G& M% [
细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水
. ~& p0 g/ M4 o二.PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：
* M* Y: d9 [" {. m# G. E1.溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4•H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。 - M( S0 n6 @1 z
2.移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 : y2 b( w' x; m( P: V
三. 胰蛋白酶溶液的配制与消毒： $ K4 p& S- o4 v a, N& l+ x
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
6 X2 x1 @* Q9 {( w2 {1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。 + a8 A1 v% ?' T* K1 D
2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
6 K Z: I! ^- t5 M# o- o四.青、链霉素溶液的配制于消毒 9 l- W! T2 K' i7 g& K% S
1. 所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。
/ P8 o5 V: q( D* h8 K- a( H2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。
1 [7 U. g8 m# Z4 G( F3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位＝1微克？) d6 ~8 S* O" p1 Z* \( \
五.RPMI1640的制备与消毒： 0 e0 |% F$ `2 U7 I
1.溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。 ' l& C" r! ~+ g& }9 c; O" @
2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。
: C, a- G7 R* p& Z/ J3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。
' w! `1 t2 h0 @4 c1 A1 p4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。 9 f" ~6 I$ i+ I* ^4 `
5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效）; L( Q& ]# h" g: X2 V" Y( R8 X5 J
种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。 |
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发表于 2009-7-14 13:05
