细胞实验室培养中的无菌操作技术

jinyuwei

细胞实验室培养中的无菌操作技术
6 \. C5 ?4 F' x' V6 S# S1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间 污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作台面。操作间 隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 0 X: N4 }3 M. _
2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操 作。
8 A' B: A" \0 r8 }4 z3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°取用， 尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
8 }% t' a5 x7 A! Y7 J, v3 s4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 9 O' ~9 i+ Q) M
5. 定期检测下列项目： 0 ?0 ?3 X" V7 H( R1 e
5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力 # Z% m* p- m5 G( B
5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。
* D1 ~+ k, k$ p6 p4 f/ s1 y( V5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 * W- ^' A9 ?7 @7 j) J. v7 A! f
6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。

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马上要开始做培养细胞试验了，作为一个新手，得从零开始，在园子里逛了一圈，长了不少见识，想想可能有和自己一样的新手需要帮助，就把自己的收集到的资料和以后做试验的经验过程逐期贴出。希望对向我一样的入门级战友一些帮助。* Q+ F* ?+ g; c" {/ |# R
本贴为第一集——无菌要求4 K4 T7 F4 B& s* Q
无菌，是一个贯穿了我们整个医学生涯的概念，从第一天穿上白大褂时起，无菌的概念就逐渐成为我们的生活的一部分，直至成为一种潜意识的习惯，一种自觉行为。对于细胞培养来说，无菌要求更加严格和重要。闲话少说，进入正题吧。（本贴主要引用中国生命科学论坛，由于主要为基本原则，故引用为主）
# m& i/ _* {. k' \9 O# E* J- j无菌室的灭菌：
0 x& T. H4 H% a) u4 {) [( |1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。 : f+ l) l  A8 a  r+ M% j4 D& F) q1 M
2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射
/ z% Q# H7 g; G3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟/ s* R6 }3 _3 q4 E6 d
4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。/ L6 o" ]) ^7 J
实验人员的无菌准备：
  E6 ~$ k* ?1 |$ W- D1.肥皂洗手。- R6 u2 w$ W4 Y" N% \, E5 C
2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋% _2 P1 _% x9 e0 C4 K
3.用75％酒精棉球擦净双手。
5 H* v$ _' ~3 V0 M& Z无菌操作的演示：
3 ~4 Y( P" ^1 E1 K4 y1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面
  z  n! ~/ C+ k6 W5 j# B2.靠近酒精灯火焰操作。
4 q; _# v- k' p7 U$ t3.器皿使用前必须过火灭菌7 }6 w# Q  b! S
4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。
6 z$ h/ H- q' P5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。
6 p+ f+ z; v( b* T8 H6.吸取两器械的清洗和消毒
! d  H7 O% Q4 F' h+ R玻璃器械洗消： 8 i$ I2 i) ^3 ]: ^* `  x
一、新的玻璃器皿的洗消： # h) k* |& E% p) Q+ H9 j3 t
1.自来水刷洗，除去灰尘。
' ^6 O2 w: F, d# G/ A" J2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。  Z; Y: ]2 E8 N1 V; e1 ~5 l4 y
3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。
! D- h1 O, n4 v7 E" S$ {; Z2 N4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。
& Z4 E2 N$ L+ ?0 o! N, O( `' p5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。. ]  M# r! c5 o4 E4 f, h2 ^+ c$ _8 M' Y
6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。3 C  U1 D# t% ?# B4 `$ G5 ^: }2 _
7.高压消毒后烘干0 K4 p* I) Y4 I( ~3 W9 C
二、旧的玻璃器皿的洗消：
' k6 H; X. ~. b+ [0 `2 @8 m  R1．刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。: a/ ^8 ^. I- J6 \
2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。
' W) e4 J' a: |* t7 p( B( ]3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。, G$ w, a# ?' ?* c+ d) G
4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）8 z# Z7 A: r' e& q% E
5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。8 t8 m' D: |; B: o$ l
金属器械洗消： 3 Y6 b- G2 M, B1 V
金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。  [5 x6 H' K+ r& t- p  t0 c  }5 X
橡胶和塑料：
, W- L8 m: q3 V, I# S3 Y橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：
( c% ?8 c* b/ n' L- H  v1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。 " C6 z( ~9 U* ~" I  a7 P
2. 胶塞烘干后用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。 ' [, ^) ?8 S% }5 m( Z& k1 X# n+ x
3. 胶帽，离心管帽烘干后只能在2％氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
$ O+ q6 L6 |; G4 z! w% x4. 胶头可用75％酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。
- v" i: m8 N/ W; n: T" I; J5.塑料培养瓶，培养板，冻存管：
& X) |9 g* k7 [$ r6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70％酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。 5 ?: |" w) x8 @; g4 H
为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻(CoC12•6H2o)2g，30％盐酸10m1，蒸馏水88m1。 ( b. i+ k  @( k/ N
注意事项：
& q- q: `3 C. z8 F9 V1.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。 9 a" R2 E& `7 L0 _, R3 P
2.安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。 " w& r. o- m: f6 u. ^# l
3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡：A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。 . E" g" A* Q: @5 G5 l" a
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细胞培养用液的配制与消毒
$ |( V: e! v  Y& ~% B8 q器材与试剂： . s5 ^3 h3 S8 [7 Z6 h
干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。4 e% k: u5 Y9 P
具体步骤：   Y% h; [& u( y
一. 水的制备：
$ \% ~6 ~: ^9 q! f9 V7 v- z细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水
# z" Q  ~; I1 b# J9 w二.PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)： & |. k& J' c' R  k( {0 W
1.溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4•H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。 3 V; s9 q# I1 w( ~% J$ ?
2.移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
8 S6 d- A2 b( M4 ]4 R# Z- \三. 胰蛋白酶溶液的配制与消毒： ) B8 l! |/ E1 Y
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
9 L, }9 |' I9 s" b7 O/ ]+ e1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。 0 S  U6 H6 c1 G4 f0 \& G+ G' L9 N
2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。 5 _* |* a  x* I; {; `
四.青、链霉素溶液的配制于消毒
! @5 t' g4 f0 P* t9 z+ W1. 所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。
: T  t8 L# U/ t% F. }2 ^' N2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。 : u  D$ }; }9 g: K7 S
3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位＝1微克？
9 {3 W+ _2 a7 h, ^6 I+ }五.RPMI1640的制备与消毒：
$ {) V# C1 F4 k1.溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。 0 @# k5 v+ ?2 b. t; P6 C1 Z4 w
2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。
: m) M) v% R! y! `; g' F7 ^3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。
; ]8 m" @( q" z! F/ g5 k4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。 ) _2 l: d5 W% P* {* H1 ]; ?/ s6 Y
5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效）
8 c( \. g+ H, x, \种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。