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jinyuwei

新手上路

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发表于 2009-7-14 13:06 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

细胞实验室培养中的无菌操作技术
1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。
2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。
3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 7 {" {5 m2 p6 ^% U! Q
4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。
5. 定期检测下列项目：
5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力
5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 ) z# A0 r4 |( W9 F1 z5 u; F4 i
5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 ' e) S, v- T j& ^ p$ M/ T6 V( f% M6 e
6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。

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沙发

发表于 2009-7-14 13:15 |只看该作者

马上要开始做培养细胞试验了，作为一个新手，得从零开始，在园子里逛了一圈，长了不少见识，想想可能有和自己一样的新手需要帮助，就把自己的收集到的资料和以后做试验的经验过程逐期贴出。希望对向我一样的入门级战友一些帮助。3 o  K- E$ d- R4 H1 t; P1 U
本贴为第一集——无菌要求
无菌，是一个贯穿了我们整个医学生涯的概念，从第一天穿上白大褂时起，无菌的概念就逐渐成为我们的生活的一部分，直至成为一种潜意识的习惯，一种自觉行为。对于细胞培养来说，无菌要求更加严格和重要。闲话少说，进入正题吧。（本贴主要引用中国生命科学论坛，由于主要为基本原则，故引用为主）* P  p# h8 f: ]" U, B' Q
无菌室的灭菌： $ u$ v. T; R5 Y! U* g0 m4 ?
1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。 " y, U4 p$ h6 r: s" W' u- i0 b
2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射9 G$ I$ W" ?; l$ G, c) A
3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟
4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。
实验人员的无菌准备：
1.肥皂洗手。" W! ^1 ?7 o" T. c- n8 P$ R
2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋( ^" j5 Z) a# v9 {5 x( {7 {
3.用75％酒精棉球擦净双手。
无菌操作的演示：
1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面* G5 A5 G5 z1 l" F) Q
2.靠近酒精灯火焰操作。/ s4 }3 @8 ^5 D6 ]& x' A( F
3.器皿使用前必须过火灭菌; x9 U+ L( ]' w" f
4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。
5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。
6.吸取两器械的清洗和消毒
玻璃器械洗消： - ?( u0 s' Q. |0 @8 V9 O
一、新的玻璃器皿的洗消：
1.自来水刷洗，除去灰尘。
2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。
3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。! N' I  i, R8 u% R7 w# t) w& ~
4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。0 Z* b/ W5 S# M" m9 T. \
5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。& x$ W" s- K+ K0 ]
6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。1 ^: f( q. t- R2 d, z* \; o
7.高压消毒后烘干
二、旧的玻璃器皿的洗消：
1．刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。
2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。- @( D( g+ [& ^7 _% T$ `& b
3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。  }2 C. z  h% P. Y: Z. ~
4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）0 P/ B$ \) }: X3 h/ E1 D3 s
5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。
金属器械洗消： : s. x  M0 w& ]2 l% Y' i2 J1 o
金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。% X5 h8 S0 b: W3 D+ ^5 m8 J- B
橡胶和塑料： 6 x; o+ b6 [7 i: M. z; D! i& O# B
橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序： " U8 P& W0 _. ?; G
1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。 . T1 U# e3 `% o3 P" V4 M6 ]
2. 胶塞烘干后用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。 # b) Y% i. p9 r& K5 J2 f
3. 胶帽，离心管帽烘干后只能在2％氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
4. 胶头可用75％酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。 ) L7 {/ i# A7 b& F- _+ g
5.塑料培养瓶，培养板，冻存管： " k2 p* Y0 R- x/ P
6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70％酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。 ; \% N0 W1 e% \- M6 c
为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻(CoC12•6H2o)2g，30％盐酸10m1，蒸馏水88m1。
注意事项：
1.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。 1 ]6 `1 j0 p$ x) G# z- V4 A
2.安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。
3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡：A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。
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细胞培养用液的配制与消毒
器材与试剂：
干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。
具体步骤：
一. 水的制备： 9 B  E# c% x! t* G0 {
细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水" R/ e9 |+ F, k" E, N; s
二.PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：
1.溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4•H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。 3 |# d- m5 I; |& P. q
2.移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
三. 胰蛋白酶溶液的配制与消毒： ( L% K' p: E0 m( t, X
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。
2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。 4 q5 W$ w0 Q2 A! Z
四.青、链霉素溶液的配制于消毒 9 ?2 `* a' s5 _# m& r  x
1. 所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。 5 z# p: _. X0 R# Y( z$ K. F0 h
2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。 4 A, g, h$ F% j  ]
3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位＝1微克？
五.RPMI1640的制备与消毒： . O- d: e$ p6 T
1.溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。 ! T" [8 A; b% r# x" R8 P
2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。
3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。 $ c( D. |6 w" o7 W. V
4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。 7 O* U8 G) q6 \6 }4 Z
5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效）9 {6 [" ^. p! `, m6 r. \5 h  E
种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。