请教诸位小鼠MSCs的培养，为何长的如此慢？

小乖

诸位大侠,有谁在培养小鼠骨髓间充质干细胞请指教,为何长的如此慢,而且传代时很难消化?请教有和高招?

smlyk

小鼠骨髓间充质干细胞（MMC）看似简单，实际窍门不少，我从1996年起开始培养小鼠MMC，现谈谈自己的体会如下：( z5 q1 L6 Q3 n. s  N# _
1) MMC只所以叫间充质干细胞，其实其本身就又一些干细胞的特征，如向多种细胞如成骨细胞分化的能力，因此一些饲养干细胞的经验必需借鉴。所以首先要保证其较好的增殖能力而不被迅速分化为终末细胞（其中最容易出现破骨细胞），才能使其快速生长，我们的经验是：用较小周龄的Balb/c小鼠（一般用4~6周）、迅速冲出骨髓（避免长时间操作）、另外初种的细胞密度适度（一般为106)还有就是一定不要将血清浓度用得太大（不超过15%），避免细胞分化，当然最好用胎牛血清；当然第一次换液也很关键，千万不可性急，一定要等基质细胞已伸出突起，在培养瓶底铺开并有小集簇状细胞时再彻底换液，换液过早，细胞容易损失并容易分化。一般注意了上述问题我们一般10~14天可养满一瓶基质细胞，并可传代3~5代。
4 w6 m# u; A$ O' L% D  k9 D2)关于传代时不容易消化问题：MMC的确是一种很难消化得细胞，因此消化液得选择和质量非常关键。我们常用得是0.25％胰酶,另外再加入0.02％EDTA使细胞迅速消化下来，如果超过10分钟细胞仍消化不下来，细胞一般会死亡我们控制此步骤主要有三点：a)用国产低黏附得玻璃瓶养MMC b)用进口得质量较好得胰蛋白酶（一般用SIGMA),避免一次大量配制，最好分装、储存于－20oc，避免反复冻融。 c) 细胞融合成片，长满瓶后再消化！& x, p% N) C* W# c
我想，上面得楼主如果注意了这些问题，肯定能将小鼠MMC培养好

清月仙子

首先看看你用的是什么medium和什么品系小鼠的MSC。6 @6 L/ ~5 Z: o2 ^2 |( v
对于C57Bl/6J，FVB/N，BALB/c，C57BL/6-TgN(ACTbGFP)10sb小鼠，首选的medium是Iscove modified Dulbecco medium＋10% fetal calf serum＋10% horse serum＋100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0.25μg/ml Amphotericin B＋2 mM L-glutamine。3 G0 u1 X0 ~- S6 `: G3 w  `" O
对于DBA1小鼠，首选的medium是Dulbecco’s modified Eagle medium＋10% fetal calf serum＋10% horse serum＋100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0.25μg/ml Amphotericin B＋2 mM L-glutamine

清月仙子

关于MSCs生长慢的问题，如果你是用国产的四季清培养，这里我同意tigerlion所说的用15%的血清，10%的效果不胜理想，虽然有人说国产四季清还可以，但本人已试过多次，MSCS生长太慢。15%的四季清我也试过，强于10%的，但也不是很理想。后我改用10% Hycolon超极胎牛血清，细胞生长十分旺盛，而且细胞形态非常好，这是四季清血清无法相比的。如果你本人试验经验有限，我推荐你使用加拿大产的胎牛血清，价格介于Hycolon之间，效果也不错。$ |- D. ?* G' v; [8 ?' w# O
　　关于细胞传代问题，我也同意tigerlion的关点，也就是用0.25％胰酶,另外再加入0.02％EDTA。所不同的是细胞消化的时间，书上说要4－6分钟的消化时间，但实验上我们发现，如果按此法消化，会致大量细胞消化过头，倒至传代时大量细胞不附壁。我们采用的方法是0.25％胰酶,另外再加入0.02％EDTA消化1－2分钟，不要超过2分钟，在消化过程中拍拍瓶底，有利于细胞消化下来。然后加带血清的DMEM中止消化，中止消化时一定要用吸管把瓶底吹打一遍，这样下来，95－98%的消化率是可以保证的。
4 Y9 m; O$ p. u5 p" {) ?' }2 o　　以上是本人的个人试验经验，希望对你有所帮助。

why121

书上介绍说MSC的特性是易消化和易贴壁 用0.125胰酶+0.01的EDTA大概需要多久消化下来的细胞才是我们想要的MSC呢 很疑惑 看来得加大消化液的浓度了