侧群细胞步骤探讨（急）

赛伊

各位大侠，小弟最近做SP一周多了，但是就连最经典的小鼠阳性对照都做不出来，急死了。下面是我的步骤，帮我看一下，恳请建议。5 V" J+ f! i4 \# D; H4 L) a3 i
剪切小鼠后肢，取股骨和胫骨骨髓，离心，破红10分钟（室温，避光）离心得沉淀，10mlPBS重悬，计数，取5×106细胞转移至新的离心管离心弃上清，用37度预热15分钟的5ml含2%FBS的DMEM培养基（培养基已加hoechst33342,5ug/ml）重悬，吹打制备细胞悬液，取2ml悬液转移至新的离心管，加维拉帕米50uM，37度水浴90分钟，每15分钟弹细胞一次，使细胞重悬，反应结束后将离心管斜插入冰盒，冷却5分钟，4度离心10分钟，用预冷的PBS重悬，过目网上机，冰盒保存。5 r3 h/ d% x% L; j$ \  y
疑问：1，我用的PBS缓冲液，原始protocol用的是HBSS，这有区别吗？7 h( V* e! w9 k" k4 k
2，离心管我使用的是尖底的塑料离心管，不知大家使用的是什么？, R; b3 u7 Q+ b9 X2 d: @
3，DMEM中的FBS含量不知和结果有没有差异，我做小鼠一直用的2%1 h/ b/ G3 h/ B: L" ^5 L, c
4，DMEM中含Hepes缓冲液与否和结果有没有联系& K. g  o% V' n& d5 s9 G5 J
5，hoechst33342我在-20保存了半年，不知有没有影响。
3 e5 Q' T8 c( h! T急切盼回复。谢谢啦。 1 v8 f+ [& H# ]& Q: @0 q7 F  ^

$ d' f3 A. y( D+ N2 `转贴白纸一张的问题

chenghoby

你的步骤是跟谁学的？我看到的根本不是这种做法，维拉帕米是作为对照用的，你直接加了那就根本做不出来啦，建议你看看Goodmel的经典Protocol吧