侧群细胞步骤探讨（急）

赛伊

各位大侠，小弟最近做SP一周多了，但是就连最经典的小鼠阳性对照都做不出来，急死了。下面是我的步骤，帮我看一下，恳请建议。+ c- I$ c& |" O6 b0 x4 P1 o
剪切小鼠后肢，取股骨和胫骨骨髓，离心，破红10分钟（室温，避光）离心得沉淀，10mlPBS重悬，计数，取5×106细胞转移至新的离心管离心弃上清，用37度预热15分钟的5ml含2%FBS的DMEM培养基（培养基已加hoechst33342,5ug/ml）重悬，吹打制备细胞悬液，取2ml悬液转移至新的离心管，加维拉帕米50uM，37度水浴90分钟，每15分钟弹细胞一次，使细胞重悬，反应结束后将离心管斜插入冰盒，冷却5分钟，4度离心10分钟，用预冷的PBS重悬，过目网上机，冰盒保存。# A3 d0 `6 X4 L0 {: v
疑问：1，我用的PBS缓冲液，原始protocol用的是HBSS，这有区别吗？( p4 ^0 ?1 [0 D, F% W( s
2，离心管我使用的是尖底的塑料离心管，不知大家使用的是什么？1 c/ d, e/ w, V, o/ E" H
3，DMEM中的FBS含量不知和结果有没有差异，我做小鼠一直用的2%( @1 E/ P; g% C! v, ?! `# b
4，DMEM中含Hepes缓冲液与否和结果有没有联系' y7 ?9 q0 p$ Y0 V; T
5，hoechst33342我在-20保存了半年，不知有没有影响。
" Y2 M1 l2 d8 ~5 N( }, S急切盼回复。谢谢啦。
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  i4 D, o4 A4 y5 i转贴白纸一张的问题

chenghoby

你的步骤是跟谁学的？我看到的根本不是这种做法，维拉帕米是作为对照用的，你直接加了那就根本做不出来啦，建议你看看Goodmel的经典Protocol吧