关于人IPS/胚胎干细胞培养的几个问题。

上海过客

本人刚开始学习培养人 IPS细胞，时间有一个月多，感触特别的多，每次到困难时刻都有打退堂鼓的 时候 ，但是还是要坚持啊 。作为一个博士研究生，这点问题都解决不了。做研究的 意义就不大了。& r2 l$ O) I4 W; J# i+ J
    能得到克隆，但是一传代就完了 ，什么也没有了，或者长得很慢。 国庆这几天的细胞干脆就 连滋养层细胞一起死了 。也不知道什么原因 。还剩下一管冻存的细胞，不敢动了 。等把问题解决了在来解冻 。 所以有些问题需要大家的帮助，希望大家不吝赐教。8 A: b% n/ G7 D
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结合自己的经验和教训 来谈谈有关的问题 。   主要是向有经验的大侠来请教+ L1 i; i/ Z0 v9 A( x4 b
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想要说的话很多，慢慢来补充吧 7 ~4 I: X* s' l( T
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1  关于试剂的问题 。 我会把详细的资料贴上来 ，大家看看有没有什么问题。
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  K# u+ U3 G9 U/ F3 S8 f培养基 和血清替代品 ，NEAA，GLUTMAX 等见图片所示 。但是 有两个问题没有注意到：  a 2-巯基乙醇，但是考虑到实验室有就没有买。可是实验室里用的是化学试剂级的不是 细胞培养级别的 。这个 问题 是不是会影响到我的细胞培养很难讲。( b/ B3 N: y' V: R% ?
        b bFGF 的问题 ，报价单上有 两个，当时图便宜买了价格低的那个 。但是国庆这几天反过来看资料的时候 没有看到 PHG0024用于胚胎干细胞培养的说明，真是欲哭无泪。 不知道 是不是也会影响实验的进程。 另外就是 bFGF 的配置 ，参照了wicell的方法 ，但是分装的的管子 里每次解冻时都会看到白色的沉淀 ，很让人担心啊。
7 a2 q3 L* s/ G$ C4 q( z# P; v配置的时候 是用的 超纯水配的BSA 然后溶解 bFGF  .并没有用PBS来配置0.1%的BSA。 知道大侠 请给一个详细的说明吧，包括Bfgf的不同货号的区别和配置的方法。
3 h& h2 {3 f2 p, N$ s% `   2  MEF问题 a 品系： MEF我用的是 昆明鼠的孕鼠，因为当时西安能提供孕鼠只有这一种。我也看到有人用昆明鼠来做滋养层，所以就采用了昆明鼠，不知道有没有什么方向性的错误 。
" `( g0 ?7 x0 _, `& s              b  培养密度 ：第一次做 ，密度太大了 ，接种第二天细胞就挤到一起了，伪足都没有了 。这样的细胞老化的快 ，很有可能影响 到胚胎干细胞的生长和增殖。  10.1 期间我又做了一次 ，但是密度还是有点大 ，主要是太贪心，所有的胚胎都想 用，考虑到培养箱的空间有限，所以 每个T175的 培养瓶装了两个胚胎，密度还是比要求的大了两倍 。
% X3 {9 W8 E0 _4 k8 F) j# w    3 传代的问题 ，尽管可能由于以上的问题会造成细胞生长和增殖速度的问题，但是还是有克隆长出 ，于是又面临传代的问题 。 用的是机械传代的方法 ，用5寸的巴斯德管拉的 挑针和吸针。  传代中的问题 8 |( I; E5 R! |) ^; K2 ~3 L
      a:  总是在 挑克隆的时候 才把MEF的培养基换成干细胞的 ，这个不知道有没有影响2 @  s- `3 \2 ]4 Q
      b: 自我感觉 培养板在超净台上暴露的时间过长，不知道会不会有影响
/ A/ N( k( [3 b3 ]/ p* S      c: 划得克隆 总是会卷起来，并不是一个个的小块，不知道是什么问题。原打算用RT检测一下细胞团是不是分化了，但是细胞少就没有做 。  猜想如果是分化的细胞可能会有这样的 结果 。
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# i* Q" p1 M& W' I( D/ a        以上是我 遇到的一些问题，以及需要注意的地方 。 还需要大家的帮助，完善我的 实验流程。  陆续补充吧。

上海过客

没有人回复啊 :'(6 k: A$ S6 h6 q. T# t2 \
1 X) ?) a. T( r1 R% l/ F0 p
已经对培养基和MEF进行了改进  。