求助：SD大鼠神经干细胞流式检测！！

xialiguang

各位前辈大师好, V8 L& K. x5 G' u3 N
我做的是SD大鼠的神经干细胞. N: _4 X% q2 _' m
干细胞养的都还不错
, p- w' n1 [4 L需要流式检查四种胞浆抗原（产生四种神经递质的酶）9 @+ O9 V5 G/ F4 k. r1 s
现在遇到的问题是：1.神经干细胞的流式参数如何设置？跟常规的人血液标本相比需要注意哪些事项？
; u' j. o- ^- p0 q0 n/ \5 \                  2.SD大鼠的神经干细胞是否比常规一般的人血液中的淋巴细胞要小？（个人感觉是要小？但是具体怎样需要大家指点！）
5 P  G0 ^7 C1 X8 g3 [0 [                  3.如何避免使神经干细胞在制作单细胞悬液时细胞碎片少点而且单细胞效果也要好点？
  T6 X  a( O) M! n& |+ F$ s4 {  y0 ]迫切需要大家的回复！！！
: V; F. Q$ |9 j9 h; K* H- Q9 u谢谢大家！！

huangzhenbo131

回复 1# xialiguang 6 k8 K3 @6 v% B$ H
谢谢你的问题，这方面的实验做的不多，不过可以提一些意见供你参考。/ W3 d7 M& c% d0 e, R# G
1.首先你做的是FASC检测，而不是FASC分选，所以流式参数要求不是非常严格，可以参照人血液标本，或稍加改变。
" _. r/ n" d  I* `2.SD大鼠的神经干细胞是否比常规一般的人血液中的淋巴细胞要小？这个不是很清楚，只知道干细胞一般核质比都比一般的细胞要大。但我想神经干细胞与淋巴细胞不会有几十倍的大小差异，所以对流式影响应该不会很大。* i) Y8 H, [( |
3.关于细胞碎片的问题，看你的神经干细胞是贴壁培养还是以神经球的方式悬浮培养，在消化时控制一下胰酶的浓度和消化时间，离心的时候条件也不要太剧烈，以免压碎细胞，其实这些也是一般细胞制作单细胞悬液时应该注意的，这方面的技术问题，你可以参考一些FACS的操作规程注意事项。. j1 Y4 o* B# G& `. s4 L
说了这么多，好像也没帮上什么忙，关键你可以做一下预实验，FACS的技术参数的问题你可以问常做FACS的操作人员。

xialiguang

谢谢！斑竹

jennyshy

流式检测一抗是不是最好带荧光啊，这样减少步骤

luckydog

没做过，学习中

ygplay

1、流式细胞仪应该有相应的参数；0 i- M2 M1 X7 n5 V4 E/ ?2 A3 y* r- i" h
2、SD大鼠的神经干细胞是比常规一般的人血液中的淋巴细胞要小；4 k  s1 u  v# g1 o5 S; W
3、如果神经细胞是从大鼠脑组织提取的原代细胞培养，建议你在制作细胞悬液时，用玻管而不用胰酶和EDTA。采用机械法提取：把玻管烧成不同孔径，由大到小分4次，冰上沉淀5分钟然后把上清转移到第二支管。
+ E# w9 u0 R  j4 K6 T   做细胞培养手要轻要快，组织打入悬浮管时要保持30°角，轻轻推入，转数不能超过1200epm/5分钟（细胞处在界面肯定会破碎）

ygplay

补3、也可以试用胃蛋白酶消化，浓度低一点，时间短一点。

青萍红檀

回复 ygplay 的帖子  K: B/ k) Y: A% R8 F: R8 R
+ h9 e) N9 A& O5 z! L% k3 \
你好，我想问一下：1、做神经干细胞的流式检测nestin时，在加抗体之前需要破膜吗？3 M9 l5 K" s5 I5 U2 @% x9 e# ]
                                2、孵育是在4°还是37°好点？谢谢
, W+ ^& Z5 T) @- u  U

细胞海洋

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SWY

原则上只要抗原在细胞膜内，做流式加抗体之前都应该给膜打孔或者破膜，否则抗体进不去。