|
- 积分
- 0
- 威望
- 0
- 包包
- 1
|
小鼠胚胎成纤维细胞的富集# K4 T/ t8 |9 v; |7 V3 a
$ F" R6 u; C3 w# `. u
1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。" C$ R. n; X, c+ ^
* ~% l) w+ V: K- d1 \2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。% x" x& m$ I- J+ ~9 f# V4 N
! }! w, j) j/ N( z+ J2 S: j3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。
0 ~! e3 F" t+ b! A( E3 L7 t/ \/ s9 p8 V' C1 l( j, Y) _2 g. k
4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。
5 R ?* T/ W* b5 U
9 _) I. N: ?& X3 s8 [( P4 N5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/EDTA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。' s, g5 r p2 |) a& q8 F2 m
6 E" P/ t# B- [# b, e. c6 c7 o' W
6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。3 n- C" V' ]. ~2 p. j
0 s8 g2 {1 M- p) o7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。* }6 w# z" q) P$ {
% o* t q, y3 P
8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。. C0 w( k0 q4 I. @+ M" ^# T6 M
) k4 z9 H: V5 v' m0 m0 T( {; a7 ]9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。
" r; t3 g+ z! T7 j7 o9 X- V5 _. o" @/ x4 S
10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。# Y' {0 z- Q% u4 V) f0 ]
: h8 @) | B2 \8 i11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。
7 |0 m. ?+ m u
- @ O9 s7 x7 k e# \* [12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。
5 ^( h* x9 K, `: ]1 Z; ^, r3 P8 Z( i1 j2 V3 U
13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。5 q9 B! h% J2 q& y* J. N9 `
n/ `9 I9 H5 x. X9 G注释：
5 `$ |. x \$ {6 x3 k& _6 U* u0 @2 }1 o* k0 V5 k) |! v9 L
我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。
6 ~# E- a6 z" w( k( a% P7 d
2 L5 U0 I( Z& R培养基成分：6 E. R+ {+ }$ J" |
$ g% j Y' f" n9 }. d; z; `
88％ DMEM5 h# n; {$ d# |; i3 y2 j
2 [( P5 E, A8 {; |% W10％ FBS
4 `6 F+ l) K; V2 `" K3 k
. p8 S0 a; j+ P v9 }3 A1％ NEAA
- }1 e' ^ E9 T/ Y. Q n' F/ \
& C& ^9 t }, O2 B2 g( d1% 双抗0 O1 h% o# a p
+ D- S5 r% U& z0 K+ O' i
对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。
7 a1 ^& n2 X# T9 }
6 N6 V! p# ], `6 Q2 G小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代1 j) ^# | }0 ~+ _- n
& c% ]& _: s, u' z- @7 p! [1、移去MEF培养基' S; I0 C9 M5 t, X! u7 n( c5 O
T9 j4 {2 n* b. d! a' {& e# e2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。
, S( k9 P: E1 o) D. D8 W
- e' w7 v' ?8 O3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。
5 Y: b* A3 a. c& N- u( X, ~; e. z6 E* v, ^/ m
4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。3 K/ i' P8 w+ G3 o
7 J2 w7 I" p! C: p" H5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。
9 H5 Z3 o' k P6 t: A$ u
% q1 l% t4 y5 E2 U1 W1 E, K3 g+ C6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。
% c, g5 g# V9 R Z* [1 }4 P9 q- B5 k! e; U1 D
7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。
' m" ?8 Y5 K# m7 d' I# U, p
3 X" P$ m- [5 f; h3 a8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37℃培养箱中进行培养。
* L9 Z8 q3 ?3 f0 o- V2 R
% r8 j% A% e, |注释：
' K+ s: @% ?* U; P, N5 }; G3 S6 n m, a, k5 N! x* R) l5 q, U! q
MEF培养基成分：, E5 L b4 k7 A4 n/ G
! e Q4 U, J: L+ l, H" Q
89% DMEM (Gibco # 12100-046): g/ l7 i$ Y1 t7 m' v; \4 {
$ s; Q( g+ E* m
10% FBS (Gibco # 16000-044)5 o e. [) ~! g& J
( X0 J" F; l$ d; j; l: ^8 I1% NEAA (Gibco # 11140-050)- N1 s& B0 b* k I6 H
# S4 Y$ S4 K; l7 c" B$ @MEF每传一代就会生长得更慢些。你第一次传代的比例可以是1:5，但是最后一次的传代（第4代或第5代）比例应该是1:2。 G% a i( b$ [+ X
1 o, Y9 ?# F$ N; Y c, ?小鼠胚胎成纤维细胞的冻存
/ M% T7 c# e& p+ z5 z6 K$ D5 q S' {
1 L, X% B! W. v- c1 k% D& X重悬培养基：; Q" r2 {6 [2 ^( @
' F) _- p7 W1 J80% DMEM
& E, \/ D) z# a2 ?2 ]+ R
* P7 t5 G, s p: b4 v5 `" c20% FBS
+ Q7 p: o* O1 S: ^, k4 r7 |
|2 z/ r8 E: A7 U# O0 M, C1% NEAA
6 G* P$ u: N% x' v9 C6 \
+ V v5 E3 E, r' i& w冻存培养基：
" G8 T3 |) i1 ^, m2 X. E: k2 l' N& { L& w+ r) ^. p2 a, e0 c: J( Z1 x n g
60％ DMEM
: `& m3 A8 Z ?0 P0 [4 X, N3 Y$ m2 k% `* D
30％ FBS
+ V: w4 ~9 n8 _# ~& L. w
" j- x: K3 B+ ^1 s20％ DMSO0 o. ~2 m* H8 I4 z! r2 _) T
4 p U x* o# l2 Y* ^
1、用不含钙镁离子的PBS洗一次细胞。
$ O" G! K" D1 G4 Q$ C
( w2 |& ~: I1 m. ^+ _, E! E2、加入胰蛋白酶/EDTA37℃消化大约5min。
Z3 z$ F( [4 e& }# `6 Z
) g1 g M5 P9 }# p5 S3、将细胞吹打下来。
) ~* `% c! \3 A- |$ P
0 ^" \1 o3 i, A3 \! l4、加入与胰蛋白酶/EDTA等体积的培养基以终止胰蛋白酶的消化。9 y; O/ O7 E. i7 V" Y! }% y
. |5 n2 B! c" X& \
5、吹散大块组织。如果还有大块组织存在，可将悬液加入到50ml的管中使其沉淀。. n' o$ d$ a, O5 C8 A4 Z' ?8 g
3 D7 ~9 K& e# h' K5 m1 d- R+ T3 F6、取上清液，将其分装到锥形管中，1000rpm离心5min。
$ L8 N3 f" I) U& {0 M. d, H
% {8 a, O6 ?/ j7、每个冻存瓶中加入0.5ml（冻存液的一半体积）的重悬培养基重悬细胞。5 q! ~! u' C8 J& f( ?7 }0 Y7 d5 P
* W) O. c# o/ q+ C7 f
8、逐滴加入等体积的（0.5ml/瓶）冻存培养基，混匀。现在DMSO的浓度是10％。
) y9 E. x" q6 G# f8 ?& B: d3 ~' S# X( w7 s$ m# Z" E/ n
9、每个冻存瓶中加入1ml的细胞。
/ a/ K6 b* d5 e0 V! Q7 }
, T% u6 U! m% a10、迅速将细胞转移到冻存的容器中，-70℃冻存过夜。（细胞不能长时间放置在室温而含有DMSO的情况下）: E2 q+ d. e) P% H4 [( M: r
$ j# K, A* p1 |: C( p- M
11、第二天将细胞放于液氮中长期保存。/ q. C$ A' K5 m- P! G
0 r: u2 B, H, I2 k) U7 C- p) B
注释：
* S8 R; [6 V7 C1 `
; d! x; R7 f8 q提前标注好冻存细胞的以下信息： a9 a$ x; F3 {& X+ T
* {7 n7 M! U2 Y- v# g# Z0 s
细胞系名称
' O& X# j) y) ?/ c* T% e+ W
3 O3 i; Y& X; _" e, `: r, S/ W8 m: S传代的代数3 F, y* a$ H, t) ^* S% K
/ p, S7 I. x: W+ n: E$ X1 C" l冻存细胞的数目
, F# i9 L6 F2 r4 b G; q) u& A- Q K3 w& {1 J, f
日期; g) a- v- o0 W! C$ ^
+ d T% E5 C! N3 m# Q0 I2 Z; s
Initials) I. K- n6 S! p4 e- T4 n) d
- ]' {* t1 m" i% n6 d注明冻存/解冻形式
* z/ U b( j" |$ }1 X( N5 Y2 P- w$ k1 p9 B# h3 `
小鼠胚胎成纤维细胞的解冻/复苏7 \' {" `: O) w, Q0 ~, e6 \2 Y' G9 S6 v
# i* H3 e$ j% l) e7 w1、将冻存瓶从液氮中取出。3 c* p; @! K0 o" Q2 \, F
; a0 E. }: w6 [$ C8 \2、放在37℃水浴中快速解冻，being careful not to immerse the vial above the level of the cap.
* N9 e0 N" X1 C+ R
3 z$ d, z: |3 ~( z) O8 }5 Z, t- e/ K3、当仅还有一点冰晶残留时，用95％的乙醇消毒冻存瓶的外面，并将其置于hood中。（为什么用95％的乙醇消毒？hood是什么？）
- w6 e9 o; |% L. N) D- s
) B, |0 I, P. y, |4、轻轻地上下翻转细胞一次，将它们放入15ml锥形管中。
9 ~+ \: C" R& Q1 S
- H+ d* D% C0 l5、想管中逐滴加入10ml培养基。这一步操作不能少于两分钟。做快了对细胞将是一种打击，你将得到比其他方法具有更低生活能力的细胞。
$ I& K0 D Z* }; C0 F, z/ X
( |3 `6 O- [3 w9 L1 w( p6、1000rpm离心5min。" M' y) b) J6 p4 C; V9 I
( r% j k1 V, M0 ~3 k9 W1 i
7、将细胞重悬于10ml培养基中，然后放入T75培养瓶中。4 z( r! s- o2 P! T9 q
; w: Z& }+ z: t) [ R, S
8、放入37℃培养箱。+ E% p; }' _! R. C; l
5 k3 t( E& Y6 A( p: Q- t
9、注明冻存/解冻的形式，以更新数据。
, S- W4 w% H8 P; D6 T5 R" I8 d# \- t) M) M0 N
网友观点是：
& b0 g! f0 U3 U5 F( P7 N: R5 w4 N6 O7 z4 k2 R7 A2 [
1、关于如何确底胚胎期12.5d~13d的小鼠？希望大家能够介绍一下自己所采用的方法，集思广益。我所采用的方法是选择同一天出生的三对小鼠，到成熟（8~10 w）后，分三周合笼，（每周合笼一对），然后待最早合笼的小鼠产崽后，再取另两个雌鼠的胚胎。不知道这样行不行，也没注意别人是怎样做的。另外问了几个外科的同学也没找到可以查出小鼠孕期的仪器。
- u* G: v1 |' Y4 |+ N4 }9 y( ~# \- [- X& C6 c
2、关于提取MEF的比较好的protocol
$ [7 l+ I; @% F( _* B& r5 m4 k s
8 }1 G2 Q% q6 _; h& h' ]# ^3、关于MEF转染时起耐受性如何？这个我以后主要做这些，可能会积累一定的经验，但现在肯定有各位朋友已经从事或正在从事着方面的工作，希望能够分享经验。
$ J0 c3 c" @ H# Z7 a7 z
9 b" q1 v8 \: d. |5 Q4、关于其分泌细胞因子能力？我从一些文献上发现，MEF除了作为胚胎干细胞的饲养层以外，也是研究天然免疫的重要材料，如日本东京大学的 AKIRA的实验室，大板大学的takashi fujita实验室就发了相当多的文章。从这些文献可以看出，MEF分泌细胞因子能力远远强于HEK293等工程细胞，相当于肝实质细胞，略低于几种免疫细胞。但较免疫细胞，我认为有其不可替代的优势：. H q+ R6 j6 k" K
: X% T' A8 m6 R( j4 C
（1）其并不是主要发挥免疫功能的细胞，只有在受到外界刺激时才会应答，分泌细胞因子，免疫细胞在不受刺激时也会为了维持稳态而不断产生细胞因子，即使有严格的control 组，但专门的免疫细胞即使是同一种细胞（DC，NK，T）但不同的细胞分泌细胞因子的能力也是参差不齐的。会造成control 相对不一致。& x3 k8 p$ G+ x. Z
% [+ k, n* p% F* L（2）另一方面，由于这些免疫细胞大部分都是悬浮的，不太容易转染，结果阳性率也会较低。2 q0 P; w. v# F8 p
( e; s( q: E( p; ~
（3）现在的分离MEF的方法很便宜，不复杂，而分离纯的免疫细胞（如NK，DC），需要MACS，FACS等，这对目前国内的实验室经费相对紧张的情况来说，不是很划算。因此除非是需要研究某一种免疫细胞，如果是为了研究天然免疫或者adaptive immune过程中某中基因，或者蛋白，或者某一信号通路等的作用，MEF 细胞不失为一种选择。 2 I& u5 B/ x* l9 A" N& C
) ?- |: B1 s( m$ J1 C, m网友观点：# a5 ]' t+ {' H# e
- X7 `0 y8 L0 K1、我每次取的是16~18天的胚鼠 个人觉得无碍 我倒更喜欢大一点的胚胎 更好操作一点
' F/ A* t X4 ^% G
0 I7 ?6 Y0 [5 k+ [2、我取的是皮肤 然后胰酶4度消化过夜 第二天终止消化 撕掉表皮 留下真皮 减碎 用的100目滤网过滤 这个胰酶消化的时间是个关键 时间长了 细胞容易死 时间少了，表皮不容易揭下来 我有此就是这样 消化了15个小时 结果接种下来的细胞不能贴壁 全死了
, d* L2 T) d% G" W
_# V& J+ G! G3 Q% Z% ~/ [1 Z3、我用的培养液是DMEM+10%小牛血清 培养液也是关键 因为虽然都是成纤维细胞比较泼辣 但总归是原代 可能还是比较娇嫩 我前几天就是这样 后来发现是培养液出的问题 测的PH值都8.3了 细胞不死才怪 毕竟细胞耐酸不耐碱
+ G( a9 T% W* ~' r8 t s7 Y; L
. a/ s" N" C' J0 J! z z5 @4、原代培养的最大天敌还是污染- z: U# {( ~7 I8 ~; }, ]
- y* _, u6 ?! `- U
网友观点：: e" a) J+ e- _# @0 T' F z
5 M/ D, u5 v$ f, ]& X1 r8 E
MEF对培养基和血清的要求不高，一般的都行我用过高糖DMEM和D/F-12，生长情况都行，而且看不出什么差别。血清也是以前用几百块钱的国产标准胎牛血清也长得也不错，因为要养干细胞，所以现在换成进口Gibco胎牛的血清（两千多/500ml），感觉细胞的状态确实好了一些。我的血清浓度一般是16.66666%。
5 D2 z, H; I; D9 @9 @' K
6 [4 k3 Y- Z0 ?' ~# `: N网友观点：
/ r! X" j& ]5 X0 r1 Z& t7 S" ]
* g$ g- `6 V# E; q7 ]. G细胞没别的，就是很容易老化，一般我都是1:5~1:3传代，3代之后细胞就出现衰老了，我感觉年轻增殖能力强的MEF应该有着清晰的细胞轮廓，细胞立体效果不错，在相差显微镜下，细胞核清晰，细胞纤长，正在分裂或是刚刚分裂的细胞没有伸出伪足，但是同样有着更加明亮的轮廓，与细胞边缘相比，细胞呈深色（我觉得是透光效果不好）。一般在4×下观察最能看出细胞的状态，此时能看到细胞呈梭形或是三角形。细胞铺展很厉害，细胞的透光效果增加，说明开始衰老。衰老的MEF最好不要做feeder,但是也不是完全不好。但是要是做转染或是感染的话，出现衰老的MEF就不行了。所以一般就是3代以内做。$ s$ `; W4 j4 s2 A! t, \
& y8 C9 P# O, I1 ^, @% }我们用的就是WiCell的protocal养，和前面那位战友发的差不多。只是我们用1mg/ml Collengase IV消化40min，用什么酶不重要，我觉得最重要的就是种盘后的换液。原代2小时不管还有多少米贴都不要，传代复苏后一小时就换。消化的时候也是要舍得，0.05%Trypsin-EDTA(GIBCO)，5min消化不下来的也统统不要。因为健康的MEF就是易消化易贴壁。老化以及混杂的其他细胞（神经、上皮）就没那么快了。
) m$ s! _6 A& v) @1 C4 t- w& ^, j+ J' x( m8 B. ]6 v, G
附带一句，易消化易贴壁是fibroblast的共性。 |
|
发表于 2009-11-13 15:06
