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小小研究员

楼主
发表于 2010-1-18 23:14 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
请问:大鼠海马细胞培养,笨人用30天龄的,试过2次了,每次都没有养出细胞来,大致过程是这样的:海马组织剪碎,加入0.25%胰蛋白酶37度消化20分钟,1000转10分钟离心去上清,加入10%含血清的培养基终止消化,1000转10分钟离心去上清,加入培养基混匀,分装培养。因为当时没计数,大约10小时候看到的全是些悬着的类似组织块的东西,基本没有细胞,是怎么回事啊?( ^$ n2 R9 y. y1 a: M4 i. j
难道胰酶没有消化好?时间不够,还是量不够?

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沙发
发表于 2010-1-18 23:22 |只看该作者
谢谢版主!这个是我刚才提的。我看过的海马细胞培养都是乳鼠,可我这里是30天的,会不会有很大影响?可是笨人不要养很久,就是贴壁就好了,再去做鉴定
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藤椅
发表于 2010-1-18 23:25 |只看该作者
海马结构(HF)属于脑的边缘系统中的重要结构,与学习、记忆、认知功能有关,尤其是短期记忆与空间记忆。Alzheimer’S病伴有明显的记忆力减退,病理检查发现有明显的海马区萎缩。我也很想了解这方面的知识。
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优秀版主 金话筒

板凳
发表于 2010-1-20 15:12 |只看该作者
干细胞之家微信公众号
你想养神经干细胞还是神经元?海马组织剪碎,加入0.25%胰蛋白酶37度消化20分钟(个人认为消化时间过长,你有没有看到消化产物呈粘稠状?胰蛋白酶对细胞的损害是大了一点,可以用木瓜蛋白酶,本人用过,不错),1000转10分钟离心去上清,加入10%含血清的培养基终止消化,1000转10分钟离心去上清,加入培养基(你用的是什么培养基?神经元的话最好用Neuralbasal,加上B27,DMEM也能养成,但是需要质量好点的胎牛血清。)混匀,分装培养。因为当时没计数,大约10小时候看到的全是些悬着的类似组织块的东西(不好贴壁是真的,这一步最关键了,平底涂布多聚赖氨酸了没?培养基不能多,细胞悬浮的话不贴壁,25厘米的培养瓶,一毫升足够,四个小时后再加入新的培养基。我花了2盒软中华的代价找老技术员的来的经验,免费送给你,希望海洋多给威望和包包:),基本没有细胞,是怎么回事啊?
6 U3 C5 {* x' o5 i4 R难道胰酶没有消化好?时间不够,还是量不够?
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报纸
发表于 2010-1-20 15:13 |只看该作者
再养不出来到群里你找我:)

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地板
发表于 2010-1-22 19:57 |只看该作者
回复 4# ziyunfei1982
8 G# n1 S9 U  _; Y
3 `2 ^+ j0 \7 ^4 F6 }4 w3 Z, a$ t* H5 K
    谢谢你!我要的是神经细胞,只需贴壁就行了,不用养很久。
/ G4 G# s& |, t) s
( T! d3 g9 n+ S( a* W9 w4 h; Z/ z加入0.25%胰蛋白酶37度消化20分钟,没有看到消化产物呈粘稠状,可能是剪得不细?培养基是DMEM/F12,你说的我没有买。4 L8 U% ~& I  ~# e, s& a! P2 w
因为看到同学直接用培养瓶,没包被过,所以我也没有,下次一定包被一下,看怎样。
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优秀版主 金话筒

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发表于 2010-1-23 12:12 |只看该作者
不能粘稠,粘稠了就坏了,那是胰酶过度消化,放出DNA了,剪刀用眼科小剪刀,弯剪,组织放到无菌EP管1。5Ml的管子里多剪剪,完了得过细胞筛,大块头除去,
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优秀版主 金话筒

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发表于 2010-1-23 12:13 |只看该作者
DMEM/F12也可以

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优秀会员 金话筒

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发表于 2010-3-31 10:38 |只看该作者
我觉得可能有两个原因:1.胰酶消化过度2.细胞没有过筛,大的团块没有去除。
8 A6 v3 ?- T/ v7 v* L. b- |另外长成这种团块装的我也遇到过,肉眼就能看到培养基里面漂浮的块状物体,后来发现还是消化的问题,加了DNAase后感觉大有改善
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发表于 2010-4-10 00:11 |只看该作者
学习啊
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