转贴一个会员在群里的问题：大鼠海马细胞培养

细胞海洋

请问：大鼠海马细胞培养，笨人用30天龄的，试过2次了，每次都没有养出细胞来，大致过程是这样的：海马组织剪碎，加入0.25%胰蛋白酶37度消化20分钟，1000转10分钟离心去上清，加入10%含血清的培养基终止消化，1000转10分钟离心去上清，加入培养基混匀，分装培养。因为当时没计数，大约10小时候看到的全是些悬着的类似组织块的东西，基本没有细胞，是怎么回事啊？( ^$ n2 R9 y. y1 a: M4 i. j
难道胰酶没有消化好？时间不够，还是量不够？

wangyxia

谢谢版主！这个是我刚才提的。我看过的海马细胞培养都是乳鼠，可我这里是30天的，会不会有很大影响？可是笨人不要养很久，就是贴壁就好了，再去做鉴定

liutianzhu

海马结构（HF）属于脑的边缘系统中的重要结构，与学习、记忆、认知功能有关，尤其是短期记忆与空间记忆。Alzheimer’S病伴有明显的记忆力减退，病理检查发现有明显的海马区萎缩。我也很想了解这方面的知识。

ziyunfei1982

你想养神经干细胞还是神经元？海马组织剪碎，加入0.25%胰蛋白酶37度消化20分钟（个人认为消化时间过长，你有没有看到消化产物呈粘稠状？胰蛋白酶对细胞的损害是大了一点，可以用木瓜蛋白酶，本人用过，不错），1000转10分钟离心去上清，加入10%含血清的培养基终止消化，1000转10分钟离心去上清，加入培养基（你用的是什么培养基？神经元的话最好用Neuralbasal，加上B27，DMEM也能养成，但是需要质量好点的胎牛血清。）混匀，分装培养。因为当时没计数，大约10小时候看到的全是些悬着的类似组织块的东西（不好贴壁是真的，这一步最关键了，平底涂布多聚赖氨酸了没？培养基不能多，细胞悬浮的话不贴壁，25厘米的培养瓶，一毫升足够，四个小时后再加入新的培养基。我花了2盒软中华的代价找老技术员的来的经验，免费送给你，希望海洋多给威望和包包：），基本没有细胞，是怎么回事啊？
6 U3 C5 {* x' o5 i4 R难道胰酶没有消化好？时间不够，还是量不够？

ziyunfei1982

再养不出来到群里你找我：）

wangyxia

回复 4# ziyunfei1982
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    谢谢你！我要的是神经细胞，只需贴壁就行了，不用养很久。
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( T! d3 g9 n+ S( a* W9 w4 h; Z/ z加入0.25%胰蛋白酶37度消化20分钟，没有看到消化产物呈粘稠状，可能是剪得不细？培养基是DMEM/F12，你说的我没有买。4 L8 U% ~& I  ~# e, s& a! P2 w
因为看到同学直接用培养瓶，没包被过，所以我也没有，下次一定包被一下，看怎样。

ziyunfei1982

不能粘稠，粘稠了就坏了，那是胰酶过度消化，放出DNA了，剪刀用眼科小剪刀，弯剪，组织放到无菌EP管1。5Ml的管子里多剪剪，完了得过细胞筛，大块头除去，

ziyunfei1982

DMEM/F12也可以

guojingjing

我觉得可能有两个原因：1.胰酶消化过度2.细胞没有过筛，大的团块没有去除。
8 A6 v3 ?- T/ v7 v* L. b- |另外长成这种团块装的我也遇到过，肉眼就能看到培养基里面漂浮的块状物体，后来发现还是消化的问题，加了DNAase后感觉大有改善

wzx6660

学习啊