谁做过FACS，能给个详细的protocol吗？

bffgbgff

我要用双标记分选CSC，我从没接触过FACS,有谁做过的，请给个实验步骤，包括样品的制备及标记。双标时候一抗能一块加入吗？分选后的细胞仍要继续培养，先谢谢了。

yuheng

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; d7 b4 Z0 A' y5 e2 `. L
没做过分选，不过处理样品应该和做流式分析时一致，一般一块加入两个抗体荧光标记的抗体就可以。

zhanglixin522

是的 两种一抗一般可以一起加的

zhanglixin522

通常步骤是 1.消化得到相应数量的细胞；2.细胞固定；3.荧光标记；4.上机分选

yuheng

这里有个解析你参考下% i5 W& y4 Y! ]: g. ~: U% O/ D7 a

+ ~" F, @" U7 x6 r4 `

hanvivian

消化得到单细胞,细胞计数,如果是核抗原需要透膜,如果是膜抗原直接加封闭液,两个一抗可同时加,4度孵育20-30分钟,离心,用不含血清的培养基重悬,上样.

bffgbgff

回复 4# zhanglixin522 + [( c, [/ n" x( g4 ?  Y

3 a6 E* P6 u' r: M3 x8 W% ?* K8 R/ }3 J
    maker，是在细胞膜上，也需要固定吗？固定的话对我的细胞活性是不是有影响？

bffgbgff

回复 6# hanvivian 5 Q3 S' Q- t, d4 V2 D3 q

: c, ?% J- U# s) K4 f, o
9 C" W- I8 n' Z4 |: N$ N* c5 z! C    培养基做分选的材料可用吗？

zhanglixin522

因为你的细胞筛选后要回收继续培养的，所以不要固定，固定细胞就死了

hanvivian

回复 8# bffgbgff
1 V/ J9 s& a- R; o3 q  B; Y
5 J3 w3 s/ U1 }) f
, W/ Q. N1 v8 F/ T) d    我以前是做上皮细胞的,我就用DF12重悬细胞，很多人用PBS重悬，我以前也用过。