谁做过FACS，能给个详细的protocol吗？

bffgbgff

我要用双标记分选CSC，我从没接触过FACS,有谁做过的，请给个实验步骤，包括样品的制备及标记。双标时候一抗能一块加入吗？分选后的细胞仍要继续培养，先谢谢了。

yuheng

! t) w3 W& @5 M, w* e& Y4 v

5 @, ?9 }2 P0 \+ A. }+ z没做过分选，不过处理样品应该和做流式分析时一致，一般一块加入两个抗体荧光标记的抗体就可以。

zhanglixin522

是的 两种一抗一般可以一起加的

zhanglixin522

通常步骤是 1.消化得到相应数量的细胞；2.细胞固定；3.荧光标记；4.上机分选

yuheng

这里有个解析你参考下& d5 g2 u2 N/ r1 S

0 V6 T# A  ?8 @: C+ {$ L4 r" p# \

hanvivian

消化得到单细胞,细胞计数,如果是核抗原需要透膜,如果是膜抗原直接加封闭液,两个一抗可同时加,4度孵育20-30分钟,离心,用不含血清的培养基重悬,上样.

bffgbgff

回复 4# zhanglixin522 0 h, H# o8 r: N* y: B+ o! \, ~" u

! D; `  g. Y4 a1 d8 V1 a; F4 u) I- Z' A( J3 L7 @( d
    maker，是在细胞膜上，也需要固定吗？固定的话对我的细胞活性是不是有影响？

bffgbgff

回复 6# hanvivian ( g. `' H7 c: V. z; z

' S+ L1 X+ k) C% s# M" ~$ d  I- V' ?
    培养基做分选的材料可用吗？

zhanglixin522

因为你的细胞筛选后要回收继续培养的，所以不要固定，固定细胞就死了

hanvivian

回复 8# bffgbgff - D" m- K6 A" m

% q9 T+ b9 a, q' U6 ~" O1 \3 f. d  E$ o
    我以前是做上皮细胞的,我就用DF12重悬细胞，很多人用PBS重悬，我以前也用过。