脐带间充质干细胞的具体培养步骤

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我前面两种方法都试过了，但是都不太成功。第一次，我用酶消化法因为样品取来较晚，用的是四型胶原酶过夜消化，第二天早上想离心发现消化后的样品太粘稠了，即使离心也有很多细胞在上清液中。我就直接将上清和下面的组织块分别种在培养皿中。三天后发现细胞大量死亡，我还以为是污染了，其实不是。我将它们全部换液，看见皿底有少量细胞贴壁，星星点点。换几次液后细胞都活下来了。但是很少，长的也不快，看来要很久才能长满。$ J3 e" |: z2 W, y0 [0 n) e2 N
第二次，我用了消化法和直接贴壁法两种。消化法没有过夜，按照一个文献中讲到用0.1%胶原酶消化一小时，再用0.25%胰酶消化半小时离心。这次有了上次的经验，我用体积远远大于消化液的PBS稀释后离心。种到培养皿中结果第二天细胞大部分都死了。是不是过度消化了？1 |& W: E! K5 A7 p4 E; A8 O; a
直接贴壁法：我剔除血管后，将组织剪碎然后再将剪碎后的组织贴于培养皿底部，中间没有留出间隔。在超净台中放置15分钟使组织贴壁后缓慢加培养基。第二天观察组织周围有一些圆形未贴壁的细胞。三天后换液，还是不见贴壁细胞，那些圆形细胞很小也不知是死是活。看起来也不乐观。可能是我性急，总想看，即使不看，在细胞爬出来之前用不用换液？希望做成功的前辈不啬赐教！

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2 Q$ u* }8 I; M, V' d. ^: P有文献说：脐带wharton Jelly中主要是透明质酸。

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两篇文献关于脐带间充质干细胞的分离方法和大家分享一下！