小鼠BMSC原代培养经验交流贴~~

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看了楼主的操作步骤，把我们实验室的步骤拿出来分享下：8 l# \, i# `% C) J# m6 w5 v
1、脱颈处死小鼠（或者用乙醚麻麻醉过量的方法），用75%酒精将老鼠全身浸湿消毒，放在试验台上。嗯，试验台也算我们自己的原创吧，因为小鼠比较小，定制的试验台不合适，我们就用泡沫盒的盖子酒精消毒后再铺上一次性的PE手套使用，同时为了方便固定小鼠的四肢，我们用1ml注射器针头将小鼠四肢固定在泡沫板上就很方便操作了。# d6 z: ?: s/ D. ~
2、用镊子提起小鼠腹部皮肤，沿小鼠腹股沟剪开，初步分离出小鼠的股骨和胫骨，放入盛有PBS或者生理盐水的培养皿中。因为这时骨头上连有肌肉筋膜等附着物，而且骨髓腔也没有暴露出来，没必要用培养基来泡着，有点浪费。
9 t- A$ W0 _. }% I, q2 ^4 b5 Y3、小心用小剪刀以及手术刀片剔除骨头上的肌肉和筋膜，用小号的止血钳双手夹住股骨和胫骨交合两端，沿交合膝盖骨相反的方向轻柔折断，这时会暴露出股骨、胫骨完整但无附着物的交合端口，用镊子夹住端口，可以很容易将干净的股骨、胫骨分离出来。$ o0 }5 S* s  ~+ m+ t$ g$ P
4、一只老鼠，我们可以得到四根骨头（两根胫骨、两根股骨），这时，还是把分离出来的股骨、胫骨泡在另一个干净的、含有PBS或者生理盐水的培养皿中。4 f/ \' S% ]3 q* f7 L. w+ L
5、用5ml的注射器装满培养基（因为要冲骨髓腔了），接上头皮针。用头皮针刺入股骨、胫骨交合端口，由于股骨、胫骨交合处自然的构造，头皮针也很容易刺入。这是需要注意的一点是，小鼠的骨髓很小，刺入不能用力太猛，不然直接就把整个骨髓腔刺穿了。剪去股骨、胫骨的另一端，推注射器，将骨髓腔里的细胞冲出来，只到骨髓泛白，这是承接培养基和细胞混合液就改成15ml的离心管了。
6 l5 W$ D1 ^" v  r. f6、将4根骨头都冲洗干净后，500g 离心10min，倒弃上清，加入10ml培养基（含10%FBS，1%双抗、1%L-glutamine)重悬细胞，分为两个25T的培养瓶。% v" L+ U% d1 V
7、置于37°，5%CO2培养箱中培养。
/ v! M# b6 Q4 `9 O8、第四天，半量换液。
. F  w& w: T  D* y/ {2 s' l9、第10-12天第一次传代细胞。
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根据细胞生长情况，每3-4天换液