请问大家关于载体的构建的经验

songxinxing

本人最近要做一个蛋白在细胞的高表达  需要去转染2 a: `7 a9 F1 d; l" P% r( q( A
现在刚开始 第一步就是要设计全长引物去P那个蛋白的全长
3 m" K! P" H7 g" V$ I1 r, C在此 我想询问下大家  全长引物设计的时候是直接按照cDNA序列设计么？那样的话是不是直接从atg开始查起，选择18-30的碱基对应序列  这样才可以保证设计的引物正好P出全长而又不至于 多出额外无用的氨基酸序列，局限于长度和二聚体错配GC量等等那样的话设计起来可以选择的引物种类就很少了6 y* N" J& O* x. w
另外有人告诉我  设计全长引物的时候应该去NCBI查找mRNA序列  从cds区上游开始设计
, M! l" P. Y+ d4 F/ r我觉得那样会引入目标蛋白不需要的上游氨基酸序列
4 i+ G5 d1 k, j2 f& X
9 e' z5 C. a) k& ^7 A( W以前没怎么做过克隆和过表达 请各位xdjm给点建议 谢谢了

saturn

从cds区上游开始设计不会引入目标蛋白不需要的上游氨基酸序列,因为蛋白质开始翻译是从你的ATG开始翻译的,
3 C* a* {- R" o2 y3 B( c* L9 o+ E* k2 y5 h/ j; F* x+ T
还有就是可以考虑让公司直接合成cDNA序列,加上合适的酶切位点,这样比较方便,不过就是有点贵

xiegm

有些载体是已经有ATG的（比如带有5‘末端标签的），这样你CDS上游序列就会被翻译，这时候最好不要上游序列。如果载体本身没有ATG，记得在你的ATG前面加入CCACC的kozak序列。