|
- 积分
- 5
- 威望
- 5
- 包包
- 31
|
本帖最后由 细胞海洋 于 2010-5-17 23:00 编辑
' T2 J5 \& |# f1 E0 \: b8 P. G( ^% y4 {
作者：郑立恒 魏会平 许松梅 何波 杨明理 王黎明 刘全胜 & D4 m! l) ]( E( C
! f, p. u/ \$ Q& e5 x& L$ U! T
【摘要】 目的: 探讨外源性EGFP基因转染修饰兔骨髓间充质干细胞(m esenchymal stem cells, MSCs)的可行性。方法: 用增强型荧光绿色蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP)作为报告基因，以脂质体法转染骨髓间充质干细胞，观察转染结果、表达情况及对靶细胞活力的影响。结果: 经荧光显微镜下观察证实：成功地对骨髓间充质干细胞实现了基因转染。结论: 兔骨髓间充质干细胞能够在体外适宜的条件下进行长期培养; 骨髓间充质干细胞可直接作为基因靶细胞, 建立稳定表达EGFP 的骨髓间充质干细胞系具有可行性,为进一步做标记的MSCs细胞的移植研究奠定基础。 , J3 n7 P- T, w5 i$ Z# F. G
【关键词】 增强型绿色荧光蛋白（EGFP）；转染；骨髓间充质干细胞（MSCs）& r5 W/ V: ?0 G0 M1 u0 W' {
+ s1 F4 T' T8 Y* J' Z# p 【ABSTRACT】 Objective: To study the feasibility of exogenous gene transfecting into bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs). Methods: MSCs were cultured and treated with pEGFPC1 with the help of lipofectamine. The transgene results were confirmed by fluoroscopy and the cell viability after transfection was evaluated by light microscopy and electron microscopy. Results: Bone marrow MSCs were successfully transfected with pEGFPC1 gene. Conclusion: The MSCs originated from rat bone can be cultured in vitro under appropriate conditions, and they can be directly used as gene target cells. Moreover, it is feasible to construct the MSCs expressing EGFP stably, which can be further applied to label target cells in the transplantation study.
, a8 c) E* _1 X) l2 a: c5 I8 G8 E6 K
【KEY WORDS】 Enhanced green fluorescent protein(EGFP); Transfection; Mesenchymal stem cells(MSCs)9 q* K! H& e: v- p: a9 z+ j
4 y( D# _/ P3 E. K! ^4 f6 M 间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）由于具有自我更新，多向分化的潜能，且容易获取和体外扩增培养，成为近年来干细胞研究的热点。迄今为止，国内外已对MSCs培养、生物学特性及治疗应用等进行了大量研究，展示了这种成体干细胞良好的应用前景 [1~4]。对MSCs研究主要包括：细胞特异性表面抗原、体外大量扩增技术、干细胞可塑性、细胞体内分布功能和治疗应用等。我们利用建立的MSCs培养，通过质粒转染并筛选培养对其用增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）进行标记，为其应用于干细胞移植实验打下良好基础。7 t9 r) n* |. L3 }1 E+ F# k& q. V
( a% Y& T' g, [8 R" q) p* p) e 1 材料和方法$ @4 |: m, D* b9 i; l8 Z! f
, l. X" u; v- S- C7 O 11 材料pEGFPC1质粒（本室保存），G418购自GIBCO BRL公司，胎牛血清、脂质体转染试剂盒购自Roche公司，DMEM培养基购自Hyclone公司，PERCOLL细胞分离液购自天津TBD公司，日本大耳白兔购自四川大学动物中心。
+ I, }8 Y- m$ T1 [* M$ m
: b" \$ _9 U/ u/ } 12 方法/ \' {7 k% _1 Z& H
4 V F( l- p7 b) j) I r# j 121 兔骨髓MSCs的培养 （1）原代培养：在无菌条件下，从日本大耳白兔股骨转子处进行骨穿，抽出骨髓细胞抗凝后用DMEM培养液进行稀释，将细胞悬液缓慢加入离心管中PERCOLL分离液（密度1073g/ml）液面，进行离心，DHanks液洗涤两次，分离细胞，加入DMEM低糖型完全培养液（10%胎牛血清），接种于培养瓶中，48h后首次换液，以后每三天换液一次，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养[5]。（2）传代培养：待细胞克隆完全形成后，进行胰酶消化传代。当第二代细胞长满时，将稳定生长的细胞传入25 mm培养盘中，当细胞生长至50%~80%融合后进行转染。1 m, K/ h8 @" s' G9 N' M+ i
% c* ?5 v, P* R, J3 d# x
122 基因转染 按脂质体转染试剂盒说明书进行操作，实验中设未转染的细胞作为对照。
0 }/ G' j& ?' i
G6 @/ m$ h& }% ` 123 阳性克隆的筛选和荧光显微镜观察 细胞转染48h后用荧光显微镜观察瞬时转染效率，然后换筛选培养基，其中加入G418（400×106g/L），三天换液一次，维持筛选作用。期间用普通显微镜观察细胞死亡情况。两周后对照细胞完全死亡，转染细胞单克隆形成，此时进行荧光显微镜观察稳定转染效率并照相。+ a. C" k, \, x# R! ^
/ S2 X' j2 e* }! x1 i6 |& \ 2 结果
0 d* r3 i5 w5 e( n& \ F) [3 L( z
. V/ U+ S) v8 n 21 MSCs细胞的形态观察 (1)原代细胞呈条索状少数呈多边形，几天后形成细胞克隆，这时细胞成堆出现。(2)打散克隆进行传代，二代细胞已经开始稳定生长并且可以平铺培养瓶底。) z+ x: q* a) g: m! U( r0 }1 x
7 Y: G s0 j! K! w/ n22 PegfpC1质粒转染MSCs细胞后的情况转染后的细胞形态比以前更加细长，瞬时转染效率大约20%，加入G418以后细胞死亡日益增多，转染的细胞5d后已经大多数死亡，8d后几乎全部死亡，然后处于稳定状态既不继续死亡也不增殖，15d后细胞开始增殖，18d单克隆形成。荧光显微镜观察可见细胞发出明显的绿色荧光，稳定转染效率基本达到100%，而未转染的细胞未见荧光表达。转染和未转染的细胞活力没有明显差别。
# H3 q" |1 \5 l r, m5 r; j
$ M+ l# X) t/ _+ J# Y 3 讨论 f# w4 m& h+ }- ]
1 v; P. p& Q5 N4 h; ]. L
pEGFPC1中的EGFP基因编码绿色荧光蛋白（GFP），在一定波长的激发光下可发出绿色荧光，而且GFP的产生无需外源物质参与，对细胞无毒性，可以直观地观察外源基因在活细胞中的表达,GFP已成为细胞生物学和分子生物学中广泛应用的报告蛋白[6]。本实验的结果证明pEGFPC1质粒能成功地转染MSCs，而转染的MSCs能成功地表达EGFP基因编码的绿色荧光蛋白（GFP）。大量的数据表明，MSCs在体内既可以作为修复组织的细胞来源，还可能同时参与多种组织的生理性更新。目前初步实验提示MSCs应用前景乐观，是骨、软骨和脂肪等组织工程较理想的种子细胞，基因转染的适宜细胞载体，甚至有利于心肌梗死、脑梗死和成骨不全症的治疗和造血功能的改善等。MSCs的同种异体移植研究具有重要的理论意义，它将有利于拓宽成体干细胞的应用领域。其中准确判断MSCs移植是否成活以及植入细胞的体内分布是深入研究的第一步。荧光蛋白标记技术是近年来迅速发展起来的一种新型细胞示踪技术，具有易于检测、表达稳定、特意性强、可以实现活细胞观察等优势[7]。EGFP是传统荧光蛋白的突变型，荧光强度增加了35倍，大大提高了检测灵敏度。本实验合理应用EGFP标记MSCs获得成功，没有明显影响细胞活性的现象，为其应用于器官移植打下了良好基础。这一结果在MSCs和其它干细胞研究中都将具有广泛意义和应用价值。
( n' t& J A& O7 `6 {( R$ y% d4 y
0 m5 i' o0 }8 b# O 参考文献8 G, o Q7 C$ I; E# f4 h3 I- W! O, O
2 [8 B6 U0 o) H3 } 1 Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284:143147
^. g) A( Q# {9 B$ S' b# a$ T: Z7 X/ X, b3 b
2 Jiang Y,Jahagirdar B,Reinhardt RL,et al.Pluripotent nature of adult marrow derived mesencymal stem cells[J].Nature,2002,418:4149
" [% V7 ]+ s' n4 S9 X# T2 S! g8 t' X
& |8 y/ I o3 ~4 i8 u$ b 3 艾国平，粟永萍，程天民.骨髓间充质干细胞的应用研究进展[J].中华创伤杂志，2002，18（8）：572574
0 Z6 S3 r3 x$ Z9 Y6 b" p
* r( ^. x7 M7 A7 Z( Z$ A! H 4 杨忠，杨柳.骨组织工程学间充质干细胞的研究进展[J]. 中华创伤杂志，2003，19（10）：766768
# B* h/ I" ?! O( X6 N, h* P" `' t7 u9 ]- o7 m3 J% M/ K
5 杨柳,戴小军，戴刚,等.人间充质干细胞体外成骨诱导培养及其生物学特性变化[J].第三军医大学学报,2002，24（5）：5095122 ~( E; `7 c$ ]- a0 i8 W9 s; l" n2 w. z
4 o' S/ d& ?: e2 `3 R4 j/ z4 h8 _
6 Scholz O, Thiel A, Hillen W, et al. Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein[J]. Eur J Biochem, 2000, 267: 15651570
3 c9 d, c0 T3 i$ o, v% z5 E. b
7 杨志明.细胞示踪技术[A].见：杨志明,主编.组织工程[M].第1版.北京：化学工业出版社,2002.202213 |
-
总评分: 威望 + 5
包包 + 5
查看全部评分
|
发表于 2009-2-7 14:48
发表于 2009-2-25 15:55
