小鼠BMSC原代细胞贴壁太紧！！求助~~

why121

回复 19# angel-sakura
) }" f4 r' ]# Q  M: h: s0 w3 g% H$ B) C. l* k. E' `, D6 M# D+ ~
- J/ t3 U) M; a" b: j
    我前几次做的也是不断的传代 但形态和流式检测都不算MSC 想请教下楼主的胰酶浓度和消化时间以及鼠源的选择等 有什么特别需要注意的地方吗？我这个图里有MSC吗 郁闷

angel-sakura

回复 21# why121
1 E2 n6 a5 C0 ]! A3 Y: h9 z, y# B7 X+ A' G9 x
+ Z" e! B: Q, b* B" }( M, t8 u: D) |
你的情况貌似和我出现的一模一样啊。。。胰酶浓度为0.25%消化时间为2min，你用的小鼠年龄是？？我的原因出在小鼠年龄过大。最好用胎鼠，鼠源的话我记不清了，不是我负责的。

why121

回复 22# angel-sakura
: a6 i: C7 `% ?" G/ I
/ b, U7 i5 X2 D- |( F$ o# Y' E8 G3 S  ]
    我用的是BALB/C2-4周的雄性鼠 现在根据本论坛的一篇文献换成6-8周的呢 准备试下 您是用密度梯度的方法吗》？能介绍下具体的操作吗？比例是1：1还是什么的？

lchanlon

对的，间充质干细胞一般比较容易消化的，我的间充质干细胞是从公司里购买的，复苏后一般生长3天就可以达到80-90%,便可以进行传代培养了。我都是用0.05%的胰酶消化，消化1分钟，细胞就会完全脱落，然后，轻轻拍打，再吹几下就可了。楼主，这样的细胞状态就开始传代，是不是有点儿早啊。细胞也就50%左右吧。可以换一下液，然后再培养几天后开始传代培养。我做的小鼠骨髓间充质细胞还是很容易消化的。

angel-sakura

回复 23# why121 ' Q! o% C8 _8 F: S
$ n7 C* l$ }) e5 ~: @: y

2 j9 D' o" E9 s5 `    我用的是全骨髓法，因为要尽量保持它的分化能力

wsrz

回复  get0715
5 c6 Y! t. k( f! ^我消化的时候是放到培养箱中孵育的，我是第一次做BMSC的原代，操作上确实可能有问题，而且 ...; y% W. Z; n& A
angel-sakura 发表于 2010-4-27 22:05

$ J' i: h, d3 o& K7 U' e' M
4 D& M! r% M7 r4 A& n) r, `* y, w/ n) W, m6 o
    我觉得长满时间5-10天都行，不一定非要求一个准确的时间。5天长满不见得就不好

wsrz

& |4 `" H& ?, K7 l

回复  小熊不杀生 " F. K1 R, x2 B5 j! u! Z) G  l
我经过多次消化后发现有许多细胞仍贴壁，并且多次消化后细胞的增长速度越来越慢，细胞形 ...
  I4 P, q0 ^) x& z. N' d3 Y0 qangel-sakura 发表于 2010-8-18 11:55

, R- F- D+ `1 `: ]3 B- x/ ?) A
/ M/ I' V( F- Y% {/ m
3 u, L/ a- R. W! c. S4 A$ @/ R    LZ，你说传到另一个培养皿中算一代，而不是胰酶消化一次算一代，我就想问，传到另一个皿中之前肯定要用胰酶消化后才能传啊，那不就还是胰酶消化后传一代。或者你的意思是你在传到另一个培养皿之前，用胰酶消化过很多次？另外，你是如何解决细胞老化这个棘手的问题的呢？我养的大鼠细胞很容易就老化，就像你说的细胞内结构都不清楚了，形态也不好。

kqyy

我的建议:
2 h3 H) N0 f2 M+ P$ M1 M1:消化体系问题:酶和edta的量和质量。. p1 n4 p6 w+ d( G: i0 I6 T
2：消化时处理：务必吸干净废液，酶要复温。* T6 e2 B9 F5 t; o3 B$ R# J
3：镜下观察消化程度。

angel-sakura

回复 27# wsrz : g, Y. O) i. k) ~' |- F! g
因为容易把代数弄错的地方在冻存方面，即防止复苏后出现代数混乱的情况，所以认为认定传到皿中后才算一代，这个是按个人习惯来的。; }& i6 Y+ I% d; N, i7 O
选胎鼠的话可能会好些，不过我做的不是大鼠，不知道情况会不会相似，此外，操作也可能造成老化。

wsrz

" `) n0 N! M" v3 Y$ i* v! P% I% O+ l+ C3 d2 ]
回复 29# angel-sakura 6 c. C9 }( z% E6 K3 i- m7 m/ U+ H5 F

4 |+ W! n! D4 w# @; k7 h
' k+ {$ X7 H5 V7 U% x    谢谢你的回复，我明白你的意思了，冻存、复苏的确容易弄混代数呵呵。