请帮看看细胞是不是发生支原体污染了？

nanocellmatrix

+ Y# }3 a- R! f" N# T$ N% `8 r9 X. n) G5 C( M1 U
最近养MSC细胞，原代到第六天就70%汇合了，有少量克隆，后面继续养了5天，直至形成很多克隆。第12天细胞传代，比例1：1.5，但是传代后4天未发现细胞明显生长，才70%汇合。2 P& C# y7 @4 Y6 n$ f* K' \; F% K

+ A2 K6 ~3 O1 C8 r, T3 i     同时实验室其他人养的细胞系生长状态不好，时好时坏。我很怀疑是不是支原体污染而引起培养环境改变。3 E4 b5 t6 Y$ ~3 ]& K
     个人猜测可能有二：: v! t* p% k  W. z# U
1）在做confocal实验时发现一奇怪现象，细胞核（DAPI）染色，发现细胞边缘有一些DAPI非特异染色，呈现串状结构（据说DAPI染双链DNA，特别是对AT序列敏感，而支原体富含AT序列），与一些试剂盒说明比较相近；

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- X6 C7 j3 t( z6 U8 w; s2）通过扫描电镜在细胞边缘发现一些类似文献报道200-400nm大小的小球；

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nanocellmatrix

# q/ g; R3 d. Z1 m% v& B, w

9 X$ a) Q; \' F1，关于扫描电镜样品：# V4 l7 [  i  ]2 H
  第一张图为小倍数，其它依次位于细胞的左上，中间和坐下位置。
+ l9 T* z0 ]; M, s' X, z( V   电镜的老师说白色的小球结构是囊泡。个人觉得囊泡应该是凹陷结构，而小球像在细胞边缘和表面。小球对应位置和DNA非特异染色位置还比较一致。请问小球是否为支原体？# `1 |& h& ]% j7 O' {8 A" I* G
2，大家染细胞核时，细胞非特异染色是否为粘附？
6 ^0 V. p1 c  ^4 I- e) `* j3，细胞核染色：前两张为单独图片，后四张为系列图片。叠加后发现零碎的DAPI明显位于细胞边缘。

wuxiao101325

我们实验室曾经在一个月前也出过类似情况，细胞不是长不起来就是很差，但是那段时间CO2培养箱经常报警气体不足，另外我们还专门买过支原体试剂盒来检测是否有污染，虽然PCR结果是阴性，但是由于没有阳性标本对照，因此结果还不能肯定。之后直到现在细胞培养趋于正常，所以最终我们还是认为最大原因是CO2气罐漏气造成培养环境变化使细胞生长不好。如果你想确定是否有支原体，可以将样本送到有检测资质的部门检测如医院（不过一是貌似医院检测的是常规四种支原体，二是按标准检测所需时间较长）

wuxiao101325

另：楼主太刻苦了，凌晨4点还在做实验

nanocellmatrix

呵呵，谢谢你的建议。我们的培养箱也总是发现偏碱，连续开两次的话，培养皿里的培养液就变紫了。

hcoohboy

你染的是ASMA吗？  ~" L3 `) c, Y
我觉得你的这个MSC已经分化了，这是其一；
& s$ d  @! N9 e& {2 h其二，那些细胞表面的点点我觉得应该是所谓的“黑胶虫”，这种东西基本上所有的细胞都有，但是如果细胞状态好就不影响细胞增殖，如果细胞状态差就会大量增殖影响细胞生长，这在原代分离的细胞里很常见。. J4 Y3 ^9 i7 G. J' D
其三：可能和分离的这批MSC状态差有关，不管是rat还是human patient来源的，由于某些未知的个体差异导致有时候分出来的MSC长的就是不好。" {+ E4 p& Y- q) k3 p7 v
其四：支原体对于大部分细胞（尤其是细胞系）来说，基本上不影响增殖的，个人经验。

pujixing

如果需要支原体检测的话，可以使用较为简便的PCR扩增方法。

xbs530515

要确定是否是支原体污染，应该考虑进行支原体检测，一般有两种方法，培养法和指示细胞培养法，具体见中国药典三部附录，建议直接使用指示细胞培养法，灵敏度更高，简单的说就是用待测细胞的培养液，加到VERO细胞进行培养5天，用H33258染色即可。

decloud2009

学习了。。

hanchao

学习