请帮看看细胞是不是发生支原体污染了？

nanocellmatrix

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; \5 k' M6 z1 q3 N2 {: @* g
最近养MSC细胞，原代到第六天就70%汇合了，有少量克隆，后面继续养了5天，直至形成很多克隆。第12天细胞传代，比例1：1.5，但是传代后4天未发现细胞明显生长，才70%汇合。
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+ g% Z. K/ f/ k- }5 b; |     同时实验室其他人养的细胞系生长状态不好，时好时坏。我很怀疑是不是支原体污染而引起培养环境改变。3 _% q) T8 d7 @
     个人猜测可能有二：' o' d! {& F' G6 A/ P7 T9 k
1）在做confocal实验时发现一奇怪现象，细胞核（DAPI）染色，发现细胞边缘有一些DAPI非特异染色，呈现串状结构（据说DAPI染双链DNA，特别是对AT序列敏感，而支原体富含AT序列），与一些试剂盒说明比较相近；

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" q# ~3 ], L6 |- r1 F2）通过扫描电镜在细胞边缘发现一些类似文献报道200-400nm大小的小球；

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nanocellmatrix

  G0 E4 D# j! C& E$ B
  C+ P) j& w9 B1，关于扫描电镜样品：! L- ~* Y# t5 q& N% g- k
  第一张图为小倍数，其它依次位于细胞的左上，中间和坐下位置。
0 ~0 E) y+ V8 D+ {6 ?   电镜的老师说白色的小球结构是囊泡。个人觉得囊泡应该是凹陷结构，而小球像在细胞边缘和表面。小球对应位置和DNA非特异染色位置还比较一致。请问小球是否为支原体？
, ]/ V6 C- p; m: R4 y  R2，大家染细胞核时，细胞非特异染色是否为粘附？% `9 l$ ?. I1 Q8 G6 t$ C" e
3，细胞核染色：前两张为单独图片，后四张为系列图片。叠加后发现零碎的DAPI明显位于细胞边缘。

wuxiao101325

我们实验室曾经在一个月前也出过类似情况，细胞不是长不起来就是很差，但是那段时间CO2培养箱经常报警气体不足，另外我们还专门买过支原体试剂盒来检测是否有污染，虽然PCR结果是阴性，但是由于没有阳性标本对照，因此结果还不能肯定。之后直到现在细胞培养趋于正常，所以最终我们还是认为最大原因是CO2气罐漏气造成培养环境变化使细胞生长不好。如果你想确定是否有支原体，可以将样本送到有检测资质的部门检测如医院（不过一是貌似医院检测的是常规四种支原体，二是按标准检测所需时间较长）

wuxiao101325

另：楼主太刻苦了，凌晨4点还在做实验

nanocellmatrix

呵呵，谢谢你的建议。我们的培养箱也总是发现偏碱，连续开两次的话，培养皿里的培养液就变紫了。

hcoohboy

你染的是ASMA吗？0 @# y; M. L! h% v' c7 I
我觉得你的这个MSC已经分化了，这是其一；: K, s/ u; c' c4 [; k- |
其二，那些细胞表面的点点我觉得应该是所谓的“黑胶虫”，这种东西基本上所有的细胞都有，但是如果细胞状态好就不影响细胞增殖，如果细胞状态差就会大量增殖影响细胞生长，这在原代分离的细胞里很常见。
6 m4 y9 F8 }3 b2 w2 r0 N1 D其三：可能和分离的这批MSC状态差有关，不管是rat还是human patient来源的，由于某些未知的个体差异导致有时候分出来的MSC长的就是不好。
, @8 b; m& t- ?9 H0 x6 s; T) Q  {其四：支原体对于大部分细胞（尤其是细胞系）来说，基本上不影响增殖的，个人经验。

pujixing

如果需要支原体检测的话，可以使用较为简便的PCR扩增方法。

xbs530515

要确定是否是支原体污染，应该考虑进行支原体检测，一般有两种方法，培养法和指示细胞培养法，具体见中国药典三部附录，建议直接使用指示细胞培养法，灵敏度更高，简单的说就是用待测细胞的培养液，加到VERO细胞进行培养5天，用H33258染色即可。

decloud2009

学习了。。

hanchao

学习