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先总结一下我的实验过程：
9 z5 n6 |) z4 r4 l0 U（1）2月龄兔，腹腔麻醉，穿刺取骨髓4ml./ B4 S$ v. ]& R$ }/ C
（2）先与Gibco L-DMEM混合，离心2500r×10min，弃上清。
! }, \8 N9 W) ?3 F（3）完全培养基（Gibco L-DMEM+10% Gibco FBS）混合沉淀，离心2500r×10min，弃上清。
+ p- g7 T7 r7 e（4）沉淀分两个10cm培养盘，各加完全培养基10ml,5%CO2，37度培养。
9 Z5 o' z+ c1 M" n（5）五天后第一次换液，此后每两天换液。4 U' j- D B4 k; u# S5 c
" e! A+ ?2 W, H3 d J碰到问题如下：
# ^. k+ D0 d, L4 m+ N2 d, P U3 }# G（1）第一次换液观察，可见有梭形细胞出现，细胞呈极性伸展；也存在多角形细胞。3 G8 _2 |! g0 E, Z& y5 f8 h
（2）第二次换液，可见有的细胞单个生长，有的形成克隆，但是各个克隆的细胞密度不一致，/ z. H* E& d2 B8 f7 q
有些密集，有些稀疏。" T- D, |. D, a6 S. C8 K* U
（3）第三次换液后，稀疏的克隆里，细胞能保持清晰的边缘，立体感强。. B/ F1 m9 w ^1 x5 d( Y a
密集的克隆里细胞非常“拥挤”，立体感变差。
- i. x4 f4 D7 R（4）为了防止密集克隆里细胞过密生长，使用0.25%胰酶消化传代（未加EDTA，但细胞很容易消化），离心。! B" _. ^+ o( e/ u
此时细胞还不能铺满单层。4 m9 n0 h- Y9 q: H E j7 A
（5）传代过夜后观察，细胞状态变差，铺展得很扁平（如图）。 y2 I& o# m3 V8 {
: p+ J- p. J4 K- u7 o1 F/ {' L* V/ r. E& @* j
* f- E) n. p. e( p& Q2 n现在需要请教各位! l( I3 f- Z& H
（1）为什么各个克隆的细胞密度会出现差异？
' A. } r0 ]5 V: C N- |$ a+ L8 f（2）为什么传代后细胞的状态与原代相比会变化这么大？, D9 a/ ?7 k5 L" b# T1 a
（3）原代细胞需要生长到什么状态，再进行传代比较好？
. T: [& [4 W+ R8 m* e' t 消化，传代操作有什么特别要注意的？, r3 E& m$ @, T+ |
有老师介绍说不用吹打，可以用刮，行不行？
. \* w4 E; P4 U- O b& Z
3 X# z) h8 E4 C谢谢各位了！ |
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发表于 2010-5-4 10:38
