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小鼠胚胎成纤维细胞的制备及处理(饲养层)     [复制链接]

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楼主
发表于 2010-5-7 04:20 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
本帖最后由 qgjin 于 2010-5-7 04:30 编辑 # g2 n7 g" }& H5 i) C

- g& T# W* h4 |# X/ I, M) c* pPREPARATION OF MEF CULTURES! [9 q/ ?  U$ B+ S3 @1 g
1. Remove embryos (E13–E16) from a pregnant mouse, rinse in PBS, remove and discard
% P- e9 _+ |/ Y% }placenta and fetal membranes, head, liver and heart. Retain and rinse the carcasses in PBS.
3 |( o' j* S% P7 G" i2. Mince the embryonic tissue in 5 ml of trypsin solution, transfer to an Erlenmeyer flask containing a stir bar and a few 5mm glass beads, and stir on% ]! {1 n5 _" _' ~% ?* s8 ?  t
magnetic stirrer for 15–25 min (use shorter incubation times if the embryos are E13 and use longer incubation times if the embryos are E16). Ideally,& V, L) N+ w4 y* T; W8 {5 v, u: c( ~
the resulting cell suspension should be essentially free of any larger pieces of tissue and should not be too viscous (genomic DNA-lysed cells).
. t: A7 p' D7 t" f7 ?3. Pipette the cells with a 2-ml glass pipette to achieve cell suspension. Filter the suspension through a sieve or a screen, add 10 ml of* D& o0 F+ g9 j+ ~
MEF growth medium and centrifuge at 450g for 5 min at RT. Resuspend the pellet in about 3 ml of MEF growth medium.% M0 S" b  i. b6 J5 w
MEF growth medium: MEF growth medium DMEM (4.5 g/ liter glucose) supplemented with 15%* k, ]3 J# E8 p& s
(vol/vol) FBS and 1%penicillin/streptomycin solution for cultivation of MEFs.Store at 4 ℃ for up to 2 weeks.

( C5 |% i" k) h3 j+ C5 d+ R4 Q9 O4. Plate the cell suspension onto cell culture plates at a density of about 2*106 cells per 100 mm plate (P0; i.e., passage 0) and incubate in
7 V& }( E4 C- `. h# cMEF growth medium at 5% CO2 and 37℃ for 24 h.4 i( D/ q) c) }
5. After 24 h, change the medium to remove debris, erythrocytes and unattached cellular aggregates.
6 T5 b1 P0 K& |$ b6. Cultivate for an additional 1–2 d until the cells reach B90% confluence.
4 c9 j7 {/ p) `7. Rinse the MEF plate with Ca2+- and Mg2+-free PBS twice.
, m5 j$ N% w$ ~/ C% k' K  q- ^8. Add trypsin solution to the culture plates and incubate for 1–2 min.
2 y7 a& L" v6 v- }" w3 p; [% `9. Aspirate trypsin solution, collect cells in MEF growth medium and expand them once (1:3 split).
5 \) W$ g1 b, e9 M1 V: ]10. Freeze any MEFs not needed immediately.
7 O. |, i0 S( A! J$ I7 O: I* E% n-POINT MEFs at P0 can be stored in liquid nitrogen up to 1 year. + u) u" |$ R$ P! e6 [
11. Continue to passage cells as described in Steps 6–9 of this Box. MEFs at passages 2–4 are most suitable as feeder layer for cultivation of
/ a0 A9 |7 [+ Y# n3 Wundifferentiated maGSCs; prepare as follows.
' R& r; A- m, E' g12. Incubate a confluent plate of MEFs with medium containing mitomycin C (10 ug/ ml) at 37 ℃ for 3 h.
1 _& m' V! W5 ]) F5 v% q  i8 x13. Aspirate the mitomycin C solution and wash three times with PBS.
3 j# c) j, @8 L) M& C# ?6 _14. Trypsinize MEFs as described in Steps 7–9 of this Box and replate them on new gelatin (0.1%)-treated microwell plates or to Petri dishes
) }5 P- O9 k2 |% Oat a density of 50,000–60,000 cells/ cm2.( C6 J& C) ^9 S! l. {% m
-CRITICAL STEP MEFs prepared 1 d before maGSC subculture are optimal. Although established cell lines may grow well on 2- to
1 x8 Z, c( v4 I5 Q$ [+ k* u3 h3-d-old MEFs, it is critical to use MEFs within 1 d after mitomycin C treatment for primary cultures (early derivation steps, mechanical
. `! g* Y$ a8 b( `% h: {passaging and thawing).
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沙发
发表于 2010-5-7 09:50 |只看该作者
俺感觉这个protocol不咋地哈,有几个人用来自E16胚的MEF来做feeder?
7 }6 @& \: d- y4 Dremove and discard placenta and fetal membranes, head, liver and heart.这个也粗放了点哈!
& R1 h& z4 V$ D4 \E16那么多细胞,3ml培养基,不是开玩笑吗?
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藤椅
发表于 2010-5-7 10:25 |只看该作者
都没有人用胶原酶处理的吗?我想知道胶原酶处理的时间啊!~

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板凳
发表于 2010-5-7 12:31 |只看该作者
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回复 3# w1986725
$ j/ f  R% @0 J+ o! h+ G4 L* W差不多,也是15到20分钟左右。
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报纸
发表于 2010-5-7 13:07 |只看该作者
请教一下,是用胶原酶Ⅱ还是Ⅳ?

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地板
发表于 2010-5-7 16:05 |只看该作者
本帖最后由 qgjin 于 2010-5-7 16:21 编辑 3 n6 H  |$ E7 A0 t: J
俺感觉这个protocol不咋地哈,有几个人用来自E16胚的MEF来做feeder?8 u! {: V" Y. C" {9 O: P% f
remove and discard placenta and fe ...8 b+ J) L- u1 @  Q9 T
ppcl2 发表于 2010-5-7 09:50

- R8 j' W1 Z) d
0 `: D( _5 B5 N0 f; i1 t只是在论文中搜到的,请讲细一些好吗?(譬如:E?胚最合适?; 取哪个部位的细胞效果更好,怎么取?;终止消化要添加多少培养液?为什么?) 我是新手不太懂 请教一下。

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发表于 2010-5-8 01:07 |只看该作者
回复 6# qgjin 4 X" [9 G' v( H' |
Feeder一般用E12.5或E13.5,最迟不超过E14.5,俺取的MEF都是去头,掐尾,去四肢,内脏全去掉,剩下的躯干剪碎,再0.25%的含EDTA胰酶消化20分左右,加含FBS培养基吹打均匀并停止反应,离心,用吸管小心去除大多上情,再用10多毫升培养基重悬,培养,第二天换液,然后一直养到差不多满了。
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发表于 2011-7-6 16:17 |只看该作者
顶楼上,我基本上用13.5天的做饲养层
: J( Z2 d! H0 X) o0 F: ~
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发表于 2011-7-26 14:30 |只看该作者
回复 ppcl2 的帖子
, t9 g9 ], T4 Z. P+ F( k
( L! [; i, B# @$ y, p2 o* M" q; O想问一下,为什么去掉头 内脏 四肢?如果说头和内脏的细胞类型太多,所以要去掉,那四肢呢?谢谢!
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发表于 2011-7-26 19:21 |只看该作者
我个人觉得有一个时间范围,基本都可以使用,但不能太超过。
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