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小鼠胚胎成纤维细胞的制备及处理(饲养层)     [复制链接]

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楼主
发表于 2010-5-7 04:20 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
本帖最后由 qgjin 于 2010-5-7 04:30 编辑 & L+ C$ U8 y. W+ C7 m& Y! B
1 Q/ e) L$ S  x$ n% E
PREPARATION OF MEF CULTURES+ f( `/ i, g# u3 Z  e/ c3 F
1. Remove embryos (E13–E16) from a pregnant mouse, rinse in PBS, remove and discard, D# H* n! d& p! j" d/ j
placenta and fetal membranes, head, liver and heart. Retain and rinse the carcasses in PBS.
7 j  V' w0 L4 |7 X2. Mince the embryonic tissue in 5 ml of trypsin solution, transfer to an Erlenmeyer flask containing a stir bar and a few 5mm glass beads, and stir on
9 `( @  c2 e2 R! ~/ X; i/ n$ _magnetic stirrer for 15–25 min (use shorter incubation times if the embryos are E13 and use longer incubation times if the embryos are E16). Ideally,
5 q+ s$ Y  t7 u8 D9 ?6 H7 Fthe resulting cell suspension should be essentially free of any larger pieces of tissue and should not be too viscous (genomic DNA-lysed cells).
* A% X: T6 Z6 V, }/ n3. Pipette the cells with a 2-ml glass pipette to achieve cell suspension. Filter the suspension through a sieve or a screen, add 10 ml of6 f) q& h+ N! ~3 o; ~5 ?
MEF growth medium and centrifuge at 450g for 5 min at RT. Resuspend the pellet in about 3 ml of MEF growth medium.6 }1 b0 [3 e; I6 V) B
MEF growth medium: MEF growth medium DMEM (4.5 g/ liter glucose) supplemented with 15%
4 {, w  {' B# J(vol/vol) FBS and 1%penicillin/streptomycin solution for cultivation of MEFs.Store at 4 ℃ for up to 2 weeks.
+ ]9 f* m$ {7 m( E
4. Plate the cell suspension onto cell culture plates at a density of about 2*106 cells per 100 mm plate (P0; i.e., passage 0) and incubate in$ S& X2 N" `; `
MEF growth medium at 5% CO2 and 37℃ for 24 h.+ c0 r9 l1 o7 U6 k5 ^/ h' l. h
5. After 24 h, change the medium to remove debris, erythrocytes and unattached cellular aggregates.! M9 b" U* w- o' U
6. Cultivate for an additional 1–2 d until the cells reach B90% confluence.7 i- w0 W: R# o$ Y8 L
7. Rinse the MEF plate with Ca2+- and Mg2+-free PBS twice.1 [/ M- E; \: ^) W
8. Add trypsin solution to the culture plates and incubate for 1–2 min.  r3 [; F3 X8 g, i, P
9. Aspirate trypsin solution, collect cells in MEF growth medium and expand them once (1:3 split).9 B! R! s/ L' q, r% Z
10. Freeze any MEFs not needed immediately.
# L. q/ x# x; i: Q; P) V# ]( R" J-POINT MEFs at P0 can be stored in liquid nitrogen up to 1 year. ! v4 m0 f6 l& m: A* k: f: m4 Y
11. Continue to passage cells as described in Steps 6–9 of this Box. MEFs at passages 2–4 are most suitable as feeder layer for cultivation of- M% {- x% m+ U8 a6 E/ G+ h1 u
undifferentiated maGSCs; prepare as follows.7 }3 F1 b* w" A  b
12. Incubate a confluent plate of MEFs with medium containing mitomycin C (10 ug/ ml) at 37 ℃ for 3 h.( X. {9 b9 J' x$ K) p( m' K6 v
13. Aspirate the mitomycin C solution and wash three times with PBS.
7 k; `- g( M: u9 z0 }14. Trypsinize MEFs as described in Steps 7–9 of this Box and replate them on new gelatin (0.1%)-treated microwell plates or to Petri dishes. C% F1 |7 [0 {" e" e5 Y" b
at a density of 50,000–60,000 cells/ cm2.% {9 T1 C: u0 c& D3 B
-CRITICAL STEP MEFs prepared 1 d before maGSC subculture are optimal. Although established cell lines may grow well on 2- to
) {& m: e+ ]2 u3 c7 k3-d-old MEFs, it is critical to use MEFs within 1 d after mitomycin C treatment for primary cultures (early derivation steps, mechanical1 ^# ]0 ^9 L# _3 O, h
passaging and thawing).
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沙发
发表于 2010-5-7 09:50 |只看该作者
俺感觉这个protocol不咋地哈,有几个人用来自E16胚的MEF来做feeder?2 Y! k2 a* {4 j% q/ T1 H
remove and discard placenta and fetal membranes, head, liver and heart.这个也粗放了点哈!
3 O# v2 }# }5 Y" B. bE16那么多细胞,3ml培养基,不是开玩笑吗?
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藤椅
发表于 2010-5-7 10:25 |只看该作者
都没有人用胶原酶处理的吗?我想知道胶原酶处理的时间啊!~

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板凳
发表于 2010-5-7 12:31 |只看该作者
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回复 3# w1986725 ) {* \+ c$ g( ]' |# R
差不多,也是15到20分钟左右。
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报纸
发表于 2010-5-7 13:07 |只看该作者
请教一下,是用胶原酶Ⅱ还是Ⅳ?

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地板
发表于 2010-5-7 16:05 |只看该作者
本帖最后由 qgjin 于 2010-5-7 16:21 编辑
) v, Q8 C5 ^9 x* z" @9 Y/ b  n
俺感觉这个protocol不咋地哈,有几个人用来自E16胚的MEF来做feeder?
9 m! l- w* m6 I3 F8 V3 \, {remove and discard placenta and fe ...
0 {  F! `6 r% _. ~' ?) T: ?/ }' _ppcl2 发表于 2010-5-7 09:50

1 d! g9 H0 \- ^( T& D2 X" m) S% X5 M3 u+ z- u4 F9 p: n
只是在论文中搜到的,请讲细一些好吗?(譬如:E?胚最合适?; 取哪个部位的细胞效果更好,怎么取?;终止消化要添加多少培养液?为什么?) 我是新手不太懂 请教一下。

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发表于 2010-5-8 01:07 |只看该作者
回复 6# qgjin
+ E* }" g+ z( ?9 f- u. \Feeder一般用E12.5或E13.5,最迟不超过E14.5,俺取的MEF都是去头,掐尾,去四肢,内脏全去掉,剩下的躯干剪碎,再0.25%的含EDTA胰酶消化20分左右,加含FBS培养基吹打均匀并停止反应,离心,用吸管小心去除大多上情,再用10多毫升培养基重悬,培养,第二天换液,然后一直养到差不多满了。
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发表于 2011-7-6 16:17 |只看该作者
顶楼上,我基本上用13.5天的做饲养层/ s2 _6 m" M7 c. g# c
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发表于 2011-7-26 14:30 |只看该作者
回复 ppcl2 的帖子8 f5 o2 _3 ], ]# D. V; u

9 D  E7 x" q8 y1 d7 h" O想问一下,为什么去掉头 内脏 四肢?如果说头和内脏的细胞类型太多,所以要去掉,那四肢呢?谢谢!
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发表于 2011-7-26 19:21 |只看该作者
我个人觉得有一个时间范围,基本都可以使用,但不能太超过。
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