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luckykiki

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发表于 2010-5-25 13:32 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

肺癌干细胞有哪些标记啊

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oldmac7

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沙发

发表于 2010-5-25 14:26 |只看该作者

本帖最后由细胞海洋于 2010-5-25 14:30 编辑

abcg2作为肺癌干细胞标志的意义探讨
9 L) ^+ p" M2 n4 A, [9 ]$ E& h
作者单位：南方医科大学病理教研室广州 5105156 C& _% P8 B* b: d: m

【摘要】  　　目的：探讨干细胞标志物abcg2作为肺癌干细胞标志的意义。方法：常规石蜡包埋、切片及he染色，应用免疫组化sp法检测abcg2在肺癌组织及肺癌细胞系glc-82和a549中的定位和表达。显微镜观察abcg2蛋白表达的部位及分布，用leicaq500mc图像分析系统对其表达强度的阳性单位（positive unit pu）进行定量测试分析。结果：abcg2蛋白表达在肺癌细胞的胞质和胞膜；肺癌组织中肺鳞癌和肺腺癌呈阳性表达，弥漫分布；肺大细胞癌和肺小细胞癌不表达。abcg2蛋白表达阳性率和表达强度在肺腺癌中表达最高，其次为肺鳞癌，肺小细胞癌及肺大细胞癌表达最低（p＜0.05），且两者之间表达差异无显著性（p＞0.05）。abcg2蛋白在肺癌淋巴结转移灶中的表达特点与原发灶一致，但转移灶中腺癌和鳞癌表达阳性率的差异无显著性（χ2=0.36，p＞0.05）。abcg2蛋白在肺癌细胞系glc-82和a549中呈弥漫阳性表达。结论： abcg2单独不适合作为肺癌干细胞的标志物，但可作为肺癌分型的标记物。 / P/ x) n* O  h: J3 G
0 ~/ B3 u) e) v8 J. u" j
【关键词】  abcg2/bcrp/mxr/abcp 肿瘤干细胞肺癌
, ], S$ h# t* H& f$ r5 ^
　　abcg2属于abc转运蛋白家族成员之一，被认为是sp细胞的表型，一种潜在的干细胞分子标记［1,2］。目前已发现部分肿瘤干细胞的标志中包含abcg2，并且有些研究直接运用abcg2作为干细胞或肿瘤干细胞的标志物来分离或鉴定干细胞或肿瘤干细胞［3～5］。在肺癌干细胞的研究中，已成功证实并分离出肺癌干细胞，但其表面标志中并未提及abcg2［6］。此外，亦有研究报道abcg2在肺癌中的表达状况［7,8］，但又未从干细胞标志物角度来探讨abcg2是否适合作为肺癌干细胞的标志物。为此本研究应用免疫组化观察abcg2在肺癌组织和肺腺癌细胞株中的表达状况，分析其表达分布状况与肺癌类型和转移的关系，探讨其是否适合作为肺癌干细胞的标志。, `/ @" T1 @6 |, W! @

　　1  材料与方法; ]% Y+ f0 f! c8 `# \

　　1.1  肺癌标本来源

　　收集南方医院病理科2005年1月～2006年7月病史资料完整的原发性肺癌手术切除标本(术前未经治疗)86例。其中男性69例，女性17例；患者最小年龄32岁，最大82岁，平均年龄60岁。标本经10％福尔马林固定、常规石蜡包埋、切片（厚度4μm）后行he染色。根据1999年who/iaslc肺和胸膜肿瘤的组织分型，将肺癌分为：腺癌，31例；鳞癌，42例；大细胞癌，5例；小细胞癌，8例。肺癌伴淋巴结转移者33例，肺癌无淋巴结转移者53例。" G( I9 ^) ~4 E1 ?8 q% q
- S& H8 N  ?7 M  F6 R% y
　　1.2  细胞培养及免疫细胞化学
" a2 q* m4 u  G( p
　　人肺腺癌glc-82和a549细胞培养于含10%小牛血清的rpmi1640完全培养液，置37℃、5％co2饱和湿度的co2培养箱中。细胞长满后接种于高压消毒、多聚赖氨酸处理过的载玻片上，待细胞处于对数生长期时取出玻片，用pbs洗3min×3次后，用95％的乙醇固定20min，pbs洗，0.3％的triton-x100破膜15min，pbs洗后加正常羊血清封闭10min，余步骤同免疫组化。

　　1.3  免疫组化染色
- m5 M1 c& V. g9 L4 d- P, I
　　免疫组化采用sp法。一抗为鼠抗人bcrp（breast cancer resistance protein，即abcg2）单克隆抗体(克隆号bxp-21)，德国merk公司产品，工作浓度1：50。用乳腺组织作为阳性对照，用pbs代替一抗作为空白对照。主要步骤如下：常规脱蜡至水，1mmol/l、ph6.0柠檬酸微波95℃20min，阻断内源性过氧化物酶、正常羊血清封闭，一抗4℃过夜；次日依次加生物素标记的羊抗鼠二抗和streptavidin-peraxidase，dab显色；苏木素复染（用于照相）或不复染（用于图像定量分析），脱水、透明、封固。

　　1.4  结果判断, I7 j2 S7 z% }5 p3 w. J1 m7 h

　　以细胞质或细胞膜上出现明确可见的棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。显色程度用阳性单位（positiveunit pu）［9～11］表示。pu越大，表达强度越高；反之，表达强度越低。

　　1.5  显微图像定量分析方法
; F7 K, L3 }: O  v0 ]5 t- ~- b- y
根据空白和阳性对照的显色情况，在确定无假阳性和假阴性的前提下，以细胞浆和细胞膜染成棕黄或棕褐色为阳性。用leicaq500mc图像分析系统，在40倍物镜下，每个样本随机选取10个视野，每个视野随机测试20个阳性癌细胞。每例切片共测试200个阳性细胞，用交互式测试方法测试每个阳性细胞的灰度值gβ，同时在相应的10个视野中测试背景灰度值并取其平均值gα，按文献公式计算每个阳性细胞的阳性单位（positiveunit pu），以每个样本中200个阳性细胞值的均值作为此样本的阳性单位。

　　1.6  统计学分析方法) _5 l# v" b! d' l4 h+ t
1 o4 i0 }5 y  h( O5 v& i# ^
　　用spss11.0统计分析软件行配对资料t检验、方差分析及χ2检验，p<0.05表示差异具有显著性。定量分析结果以均数±标准误( x±s)表示。

　　2  结果

　　2.1  abcg2在不同组织类型肺癌中表达

　　肺癌组织中，肺鳞癌和腺癌不同程度表达abcg2，主要定位在细胞质和细胞膜，棕黄色，呈弥漫或大片状分布（图1a、图1b）；肺小细胞癌和肺大细胞癌不表达（图1c、图1d）。2 [" F0 z" T4 G) @

　　在肺腺癌和肺鳞癌原发灶中abcg2蛋白表达阳性率分别为90％和71％，在肺大细胞癌和小细胞癌中为0％。4种类型肺癌表达阳性率的差异有统计学意义（χ2＝32.01，p＜0.01）。在淋巴结转移灶中， abcg2蛋白在各型肺癌中表达的阳性率与原发灶一致，但在转移灶中腺癌和鳞癌表达的阳性率差异无显著性（χ2=0.36，p＞0.05）。
$ v) R9 F- y) p: L
　　表1  abcg2在不同组织类型肺癌原发灶和转移灶中表达的阳性率（略）

　　注：上标分别表示与其所在组比较差异有显著性，p＜0.05。( K* x7 r' x9 S' Y/ d, y

　　a：肺鳞癌    b：肺腺癌 c：肺大细胞癌    d：肺小细胞癌- T! Q! m# Y0 D! F
4 y2 t- `  F' M8 I
　　图1  abcg2蛋白在肺癌中的表达（dab显色，苏木精复染，物镜40×）（略）% m; E5 U2 b8 n9 Y* m" x

　　2.2  abcg2在发生转移的肺癌原发灶及其淋巴结转移灶中的表达强度: r/ Q& E# Z3 m# s) \- l

　　在发生转移的肺癌原发灶中，abcg2蛋白表达的pu在肺鳞癌、腺癌、大细胞癌和小细胞癌间总体比较差异具有极为显著的统计学意义（f=12.11，p＜0.001），肺鳞癌和腺癌大于肺大细胞癌和肺小细胞癌，差异具显著性（p＜0.05），且肺腺癌中abcg2蛋白表达的pu是肺鳞癌的2.56倍；肺大细胞癌和小细胞癌之间差异无显著性（p＞0.05），pu接近于零。

　　在各型肺癌相应淋巴结转移灶中，abcg2蛋白表达的pu总体差异有显著性（f=7.8，p＜0.05），肺腺癌表达的pu亦明显高于肺鳞癌（p＜0.05），是肺鳞癌的2.00倍；肺大细胞癌和肺小细胞癌不表达，pu接近于零。配对t检验表明，33例肺癌原发灶与其相应淋巴结转移灶的abcg2蛋白表达的pu差异无显著性（t＝0.81，p＞0.05），各型肺癌原发灶与其相应淋巴结转移灶abcg2蛋白表达的pu差异亦无显著性（p＞0.05），见表2。
# M3 K1 E! D" W5 f
　　2.3  abcg2蛋白在肺腺癌细胞glc-82和a549中的表达1 X! f# v% m# @$ S2 s

　　abcg2蛋白在glc-82和a549肺腺癌细胞中普遍表达，主要定位在细胞质和细胞膜，呈棕黄色、颗粒状分布（图2a、图2b）。9 y1 `- h6 r5 l

　　表2  abcg2蛋白在肺癌原发灶与淋巴结转移灶中表达的pu（略）3 l' M$ M  Q# y

　　注：1.上标分别表示与其所在组比较差异有显著性，p＜0.05；2.*为伴有转移的肺癌原发灶。
! Y0 d8 |: C! [1 n3 I2 Z
　　a：glc-82             b：a549
7 B6 j3 d" V7 f! j0 a; w9 |) q. Y
　　图2  abcg2蛋白在肺癌细胞中的表达（dab显色，苏木精复染，物镜40×）（略）
6 V$ m( J3 m: p& q; e
　　表3  肺腺癌细胞株glc-82和a549中abcg2蛋白的pu及阳性率（略）  \* d! s; @# w# x
( Z. f$ x9 n0 ~% N+ x
　　3  讨论

abcg2是doyle等［12］1998年首先从耐药的乳腺癌细胞中分离出来，引起耐药的蛋白，所以又叫乳腺癌耐药蛋白（bcrp）。研究发现，abc转运蛋白家族中的abcg2与造血干/祖细胞泵出hochest33342染料的特性有关，与sp细胞的干细胞成分直接相关［2］。因此abcg2在sp细胞上表达的相关性提示其为干细胞筛选标记之一。那么abcg2是否同样可以作为肺癌干细胞的标志物呢？

　　虽然abcg2在肺癌中的表达已见报道［7］，但是abcg2是否能作为肺癌干细胞的标志物，尚未见报道。肿瘤干细胞是肿瘤组织中存在的极少数细胞，对于干细胞或肿瘤干细胞的标志物而言，不论用何方法，其所标记出的细胞应该只是整体中的极少数。因此用免疫组化方法标记出的细胞数应较少或极少，应呈散在或小簇分布。本研究结果显示在肺腺癌和鳞癌组织原发灶及转移灶中大部分细胞abcg2表达阳性，而在肺大细胞癌和小细胞癌中不表达。如果将abcg2认作肺癌干细胞的表面标志，那么其在肺腺癌和肺鳞癌以及在肺腺癌细胞系中呈现广泛表达的结果则意味着肺腺癌和鳞癌中表达abcg2的阳性细胞均为肿瘤干细胞，而在大细胞和小细胞癌中均未见abcg2呈阳性表达，则意味着其不能发现肺大细胞癌和小细胞癌中的肿瘤干细胞。此外，相对于高分化癌和成熟组织，低分化或未分化癌更应富于干细胞，而本研究中大细胞癌和小细胞癌却不表达abcg2。最近ho mm等［13］用荧光定量rt-pcr发现a549等五种肺癌细胞株(h460, h23, htb-58, a549, h441, and h2170)均不同程度表达abcg2在，但未提及细胞中的表达阳性率。本研究中运用免疫细胞化学染色发现肺腺癌细胞glc-82和a549几乎100％表达abcg2蛋白，若是依据abcg2的表达判断肿瘤干细胞，则glc-82和a549中几乎所有细胞均是肿瘤干细胞，这等于未标记出肿瘤干细胞。

　　由于干细胞具有迁徙的特性，癌细胞具有转移的特点，那么表达干细胞标志abcg2的肿瘤干细胞应该更容易转移。本研究表明abcg2蛋白表达在肺癌原发灶与淋巴结转移灶一致，表达阳性率和表达强度中差异无显著性（p＞0.05）。此外，我们发现不同类型肺癌中abcg2表达阳性率和表达强度不一，且差异有显著性（p＜0.05）。不论是肺癌原发灶还是淋巴结转移灶，abcg2蛋白主要表达在腺癌和鳞癌，且腺癌中的表达强度分别为鳞癌的2.56倍和2.00倍。这提示abcg2具有区分不同肺癌亚型作用。
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　　因此，若将abcg2作为肺癌干细胞标志物，其标记结果不符合干细胞应具有的分布特点和蛋白标志物表达的基本规律，abcg2能否作为肺癌干细胞的特异性标志物仍是一个值得深入研究的问题。本研究认为，abcg2单独不适于作为肺癌干细胞的标志，可作为肺癌分型的标记物。
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