人ES细胞核型检测

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1．1个6cmdish的人ES细胞生长最旺盛的一天，在培养液中加入终浓度为100ug/ul的秋水仙碱，37℃，处理3hr; E4 m* C7 t: I* }  L! v
2．3hr后，弃去培养液，用胰酶将ES克隆消化成单细胞
& I8 S0 _) j: ~5 f3．离心：1200rpm，5min) r* ~$ o& }+ _" X
4．弃上清，留大约500ul液体重悬细胞  o& v* v! d% C; N' H' l1 t
5．一滴一滴慢慢加入10ml37℃预热30min的KCl溶液（配方见下），在37℃下低渗30min' B+ q; P% U, s+ P. U  s
6．加入2ml固定液（配方见下）2 T/ T6 z9 r, q, W) z3 B3 k
7．离心：1200rpm，5min
. u3 B2 S( m/ `8．弃上清，留大约500ul液体轻轻重悬细胞后，加入10ml固定液，室温固定10min, E" r: F  J( w9 G) H7 U( A/ @
9．离心：1200rpm，5min
, n4 W3 O( X( O0 [10．再重复步骤8，9两次/ K0 t3 U. ?/ _3 d, W
11．弃上清，剩余适量固定液（大约200ul），轻轻吹匀细胞悬液后，滴片# G4 D& b$ _3 }- @
12．室温老化两天
, N2 X" O! J/ \13．65℃，4hr（注意要让温度自然降下来）$ T* e& E2 S+ s6 Y7 w1 w' X% }
14．0.1%胰酶溶液（用生理盐水配，4℃保存）消化带型
" C/ }% t2 ]' N& v. z, _# O15．37℃水浴消化（时间需要自己掌握30s，45s或者1min都有可能）
% S. l' x4 J! K, [5 M: Z: D2 B0 _9 \16．Gimas染液染色5min，镜检
! x* [3 ~* _2 Z7 z6 G) Q7 G; F2 [8 @9 k
低渗液KCl溶液配方：" {4 v9 X# a0 L/ D
0.16gKCl+0.125g枸橼酸钠溶入50mlmilliq水中
" K+ l: D0 J0 ?8 t. L3 U" g1 m' r4 o! q% e' D( R
固定液配方：冰醋酸：甲醇＝1：3
2 e2 f. y1 J; L% E0 F5 X/ _& v
# E! R! I5 H6 D1 \滴片用的是冰片：玻璃片用95％酒精浸泡过夜（去掉表面的油脂），在-20℃保存，滴片时从-20℃拿出，尽快滴上。

camille4278

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