人ES细胞核型检测

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1．1个6cmdish的人ES细胞生长最旺盛的一天，在培养液中加入终浓度为100ug/ul的秋水仙碱，37℃，处理3hr
. g& m. w% x9 H. J2．3hr后，弃去培养液，用胰酶将ES克隆消化成单细胞
2 \8 p2 }1 ?" p! `0 P3．离心：1200rpm，5min
) U1 q5 J* V2 K4．弃上清，留大约500ul液体重悬细胞$ L# ]! y2 ?" Y( ?% Q: g
5．一滴一滴慢慢加入10ml37℃预热30min的KCl溶液（配方见下），在37℃下低渗30min1 _( Q% m. m9 V* i8 u; N$ s
6．加入2ml固定液（配方见下）& b  @( H1 O& s2 x: M
7．离心：1200rpm，5min" L9 h) p* G7 F! f8 g
8．弃上清，留大约500ul液体轻轻重悬细胞后，加入10ml固定液，室温固定10min
" A6 d# [+ d" w9．离心：1200rpm，5min
  u$ g2 L) _& C$ t+ k& @0 i8 h10．再重复步骤8，9两次
& d1 D; O. m  s% c) _11．弃上清，剩余适量固定液（大约200ul），轻轻吹匀细胞悬液后，滴片' F" ^5 P$ I1 q  U" L
12．室温老化两天
& s1 z0 L3 }. E4 ~# w; q9 o- Q7 H13．65℃，4hr（注意要让温度自然降下来）+ W) c; X: Q$ R) a
14．0.1%胰酶溶液（用生理盐水配，4℃保存）消化带型
4 R0 j8 h# {' h' F+ s7 @/ D" O15．37℃水浴消化（时间需要自己掌握30s，45s或者1min都有可能）
3 t# G7 @" w6 Q1 `2 y16．Gimas染液染色5min，镜检' Z. ]- W- g9 e$ d" }
- U0 h7 n* P5 P1 y# L) J% t
低渗液KCl溶液配方：" X) W2 p5 |8 _. ^
0.16gKCl+0.125g枸橼酸钠溶入50mlmilliq水中) }  E# ?8 @" {* B- g9 i) Y

8 a- B8 O5 c7 ]1 x0 z$ l固定液配方：冰醋酸：甲醇＝1：3  ~5 G; C1 C6 H- ^" l( ~+ @: z

9 ?; l5 k3 h; F9 a1 L3 K+ F滴片用的是冰片：玻璃片用95％酒精浸泡过夜（去掉表面的油脂），在-20℃保存，滴片时从-20℃拿出，尽快滴上。