关于肿瘤干细胞成球实验的细节

火云豹

我要做肺癌干细胞方面的实验 其中涉及到做肺癌干细胞成球实验 碰到如下问题:# s& R, ~7 ?- s  Q

: K, o5 |" ^8 J1 ]+ |; h1.不太清楚接种到无血清培养基中细胞密度 见识了几篇国内文献所提的都不相同 而国外的我目前还没有看到 不知道谁有这方面的经验 ( X- `4 R) Z2 O+ i7 {

" _! V% W1 j  @+ d) a2.干细胞球一旦形成后,其细胞的传代和冻存复苏 和一般的肿瘤细胞有何差异之处

coldage

我来回答第二个问题，可能有不对的地方请包涵。' g: g% F  p0 O" H
我做的时候是和传代细胞冻存复苏差不多的步骤。0 V+ `* c& O* e0 M4 O* m
冻存液配方是：20%胎牛血清，10%DMSO,70%DMEM-F12，步骤是先4度冰箱30min,-20度30min,-80度过夜，然后液氮长期保存。

火云豹

我来回答第二个问题，可能有不对的地方请包涵。
3 }+ v" G; D( J  p. N8 S0 y" {) c( Z4 k0 U0 Q我做的时候是和传代细胞冻存复苏差不多的步骤。8 |5 n* X$ f. z+ h! N
9 ^# i- B) H& G0 F冻存液配方是：20%胎牛血清，10%DMSO,70%DMEM-F12，步骤是先4度冰箱30min,-20度30min,-80度过夜，然后液氮长期保存。 " G6 W! }8 K2 K9 ~; Z

6 T& k8 M( d6 n: i# {. B% i, p; _3 p3 q1 m
里面加入血清对干细胞有影响吗 什么影响

火云豹

还有 我们一般冻存细胞是加入装有异丙醇的冻存盒后加盖旋紧-80°C冰箱过夜 后取出直接放入装冻存管的纸盒 放入-80°C冰箱

lilinfeng

我也在筛选肺癌干细胞 ，接种密度很难讲，接稀了一周后都没有观察到球的出现，接密了在培养第二天就出现许多悬浮的球，我估计这只是细胞的简单聚集而已，并不是我们真正想要的干细胞，很困惑！！还得继续摸索呀！

liutianzhu

我养过胶质瘤干细胞。/ q8 u6 B/ D: \$ |9 m& _
1.培养密度：文献说,肿瘤干细胞原代需要细胞聚集，这种聚集能促进肿瘤干细胞的增殖。建议原代肿瘤细胞无血清加因子培养时5*105/T25cm2培养瓶，肿瘤细胞会贴壁，悬浮细胞聚集到成球需要三天左右，三到五天后可将两瓶悬浮细胞合为一瓶养（贴壁细胞除去，干扰，耗因子）
* j6 I- z* q( s7 a; E& _* t2.肿瘤干的传代：文献说细胞球大于1000个细胞时将其低浓度胰酶消化传代防止球体坏死。我在试验中发现，有的肿瘤球很难消化，试了几种浓度消化都没成功，细胞怎么吹也吹不散，总之看运气。我的建议是不要等到球体大于1000个细胞时才消化传代，可以在5-7天后就吹散。. P+ |8 w. y1 e  [8 p
3.干细胞的冻存：一般细胞的冻存用到血清，而血清会造成肿瘤干细胞的分化。且复苏后干细胞活性差。建议不要冻存，实在要冻存建议用血清清蛋白代替血清，成本稍贵。

hanbiao1982

谢谢

along0312

个人实验体会：
. M& r9 {7 ]+ T& N2 k    1.干细胞传代是可以用accutase,效果比胰酶要好很多，市面上卖的也挺多，就是价格比胰酶要贵。; R5 e, r* J% }* e* m+ I% R
    2.细胞冻存可以选用含生长因子的培养基+20%DMSO，我试过，效果还可以。

lsp_318

听别人说tryple效果也比胰酶好，不知道怎么样？

shy1223

回复 liutianzhu 的帖子( F# k' Z7 _8 J" F& ^

5 s' @$ Y6 }$ x8 K您好！干细胞球1000个大小是什么概念？肉眼看到的球大概有多少个？计算细胞的成球率是怎么计算的？成球后的传代是要把球挑出来还是离心消化？然后吹打？