关于肿瘤干细胞成球实验的细节

火云豹

我要做肺癌干细胞方面的实验 其中涉及到做肺癌干细胞成球实验 碰到如下问题:9 Y% o6 W2 y; p' \5 ?
. r: h5 f( G7 Y4 U! C, R& T8 U
1.不太清楚接种到无血清培养基中细胞密度 见识了几篇国内文献所提的都不相同 而国外的我目前还没有看到 不知道谁有这方面的经验 " w# d4 H' I+ c2 p) M

* z3 X7 s3 U1 H2.干细胞球一旦形成后,其细胞的传代和冻存复苏 和一般的肿瘤细胞有何差异之处

coldage

我来回答第二个问题，可能有不对的地方请包涵。$ S' |7 }( B6 D
我做的时候是和传代细胞冻存复苏差不多的步骤。- W% z% }/ B/ x& D3 @2 v1 I
冻存液配方是：20%胎牛血清，10%DMSO,70%DMEM-F12，步骤是先4度冰箱30min,-20度30min,-80度过夜，然后液氮长期保存。

火云豹

我来回答第二个问题，可能有不对的地方请包涵。
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9 ^# i- B) H& G0 F冻存液配方是：20%胎牛血清，10%DMSO,70%DMEM-F12，步骤是先4度冰箱30min,-20度30min,-80度过夜，然后液氮长期保存。 9 p* \; x$ E5 i9 D- n

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! [# b" t# X5 ?# m) N& `% \1 \里面加入血清对干细胞有影响吗 什么影响

火云豹

还有 我们一般冻存细胞是加入装有异丙醇的冻存盒后加盖旋紧-80°C冰箱过夜 后取出直接放入装冻存管的纸盒 放入-80°C冰箱

lilinfeng

我也在筛选肺癌干细胞 ，接种密度很难讲，接稀了一周后都没有观察到球的出现，接密了在培养第二天就出现许多悬浮的球，我估计这只是细胞的简单聚集而已，并不是我们真正想要的干细胞，很困惑！！还得继续摸索呀！

liutianzhu

我养过胶质瘤干细胞。1 z' f$ I: ^* F" z# r9 }
1.培养密度：文献说,肿瘤干细胞原代需要细胞聚集，这种聚集能促进肿瘤干细胞的增殖。建议原代肿瘤细胞无血清加因子培养时5*105/T25cm2培养瓶，肿瘤细胞会贴壁，悬浮细胞聚集到成球需要三天左右，三到五天后可将两瓶悬浮细胞合为一瓶养（贴壁细胞除去，干扰，耗因子）
( ]9 q6 R9 @, B1 P% E% ]7 F2.肿瘤干的传代：文献说细胞球大于1000个细胞时将其低浓度胰酶消化传代防止球体坏死。我在试验中发现，有的肿瘤球很难消化，试了几种浓度消化都没成功，细胞怎么吹也吹不散，总之看运气。我的建议是不要等到球体大于1000个细胞时才消化传代，可以在5-7天后就吹散。
6 h7 ?* }/ |2 m1 K* k$ ?/ `3.干细胞的冻存：一般细胞的冻存用到血清，而血清会造成肿瘤干细胞的分化。且复苏后干细胞活性差。建议不要冻存，实在要冻存建议用血清清蛋白代替血清，成本稍贵。

hanbiao1982

谢谢

along0312

个人实验体会：
3 U5 f  {0 s- a  v    1.干细胞传代是可以用accutase,效果比胰酶要好很多，市面上卖的也挺多，就是价格比胰酶要贵。
& `% M- i' u, ^, [5 e% ]    2.细胞冻存可以选用含生长因子的培养基+20%DMSO，我试过，效果还可以。

lsp_318

听别人说tryple效果也比胰酶好，不知道怎么样？

shy1223

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* q/ Z/ x/ K" w4 R1 b: m
# h$ D& [; j% b% s( _: s3 X# |; h您好！干细胞球1000个大小是什么概念？肉眼看到的球大概有多少个？计算细胞的成球率是怎么计算的？成球后的传代是要把球挑出来还是离心消化？然后吹打？