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神经球传代问题??  

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包包
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发表于 2010-6-9 10:53 |显示全部帖子
我的原代神经球好不容易养出来了,但传代总出问题,总吹不成单细胞,我的protocol基本如下:收集细胞培养液,1000r/min离心2-3min富集神经球,弃上清,加入tryple(胰酶的替代物,之前Nature protocol上提到过)37度消化7min,机械吹打60下左右,1ml和200ul的枪头都试过了,镜检看还是没吹散,后来用1ml注射器又吹打几十下,好不容易吹散了,接种后好多细胞都不聚球了,估计是损伤太大挂掉了,各位有没有好的传代方法啊?谢了~
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热心会员 博览群书 积极份子 优秀会员

发表于 2010-6-9 12:13 |显示全部帖子
1.加入tryple前用PBS洗三次。
. `: m1 E3 [0 J2.细胞细胞打不散,可在tryple中加入2%EDTA,应该可以打散细胞,不要强力吹打。
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优秀版主 金话筒 优秀会员 小小研究员 博览群书 帅哥研究员 专家

发表于 2010-6-9 20:15 |显示全部帖子
同意楼上意见:首先你没有用PBS或HBSS漂洗,培养液或血清中和胰酶的部分活性;个人经验好像胰酶+EDTA的消化液的消化能力比tryple强,tryple好像相对温和些。
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发表于 2010-6-10 10:45 |显示全部帖子
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回复 3# zsc78 6 U- U' o' u9 E+ [. Y6 i

0 F, M% x5 _4 J; b- n1 J0 a& {) h# P- W3 U! Z" t* y
    谢谢哦~
- ?7 e* A. R/ P0 I" p( `    我的培养基里是不加血清的,用你的方法大概需要消化多长时间呢?我用普通胰酶接种原代细胞时消化5min,发现细胞基本都贴壁了,分化出好多小胶质,是不是消化太厉害了,所以我现在都不敢用普通胰酶了....
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发表于 2010-6-10 10:48 |显示全部帖子
回复 2# wgydys 1 K1 A: [; z! v+ c! l$ r
) ?% |. `2 T$ I/ ?6 M+ O

8 y. R6 y  ^. w$ s! @0 i    用pbs反复洗,会不会对细胞损伤太大啊?而且我的培养基里都没有血清的,你在传代的时候一般吹多少下可以吹散啊?
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热心会员 博览群书 积极份子 优秀会员

发表于 2010-6-10 11:13 |显示全部帖子
消化时间长短需要根据镜下观察决定,只要细胞间连接带明显可见和粗大即可,每种细胞的消化时间不一样。
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金话筒 优秀会员

发表于 2010-6-10 13:40 |显示全部帖子
回复 6# wgydys - F3 ^0 H. U* C2 ^. ~0 j( z' t8 Y
- y+ f7 i5 j1 ]6 Q1 A' B0 z
神经球不是贴壁细胞,看不见消化程度。如果细胞有突起贴壁,细胞很可能就已经分化了。
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金话筒 优秀会员

发表于 2010-6-10 13:43 |显示全部帖子
神经球的传代问题确实不太好解决,你根据自己的实验做一组消化时间的梯度实验吧,相同多的细胞,加入相同浓度的酶消化,1分钟为梯度,看哪种最容易消化为单细胞,并且活性好不容易贴壁分化。
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优秀会员 金话筒

发表于 2010-6-18 15:19 |显示全部帖子
回复 4# lujn100
1 x) O# U$ q! r6 Z  \, M1 Y
, A3 F( |$ O7 v1 }% z* E- B$ |. l" ]8 O
    神经干细胞还能分化出小胶质细胞?小胶质细胞不是起源于骨髓吗?在发育过程中从外周进入脑内的
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发表于 2010-11-25 12:58 |显示全部帖子
用0.025%的胰酶-EDTA消化神经球
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