神经球传代问题？？

lujn100

我的原代神经球好不容易养出来了，但传代总出问题，总吹不成单细胞，我的protocol基本如下：收集细胞培养液，1000r/min离心2-3min富集神经球，弃上清，加入tryple（胰酶的替代物，之前Nature protocol上提到过）37度消化7min，机械吹打60下左右，1ml和200ul的枪头都试过了，镜检看还是没吹散，后来用1ml注射器又吹打几十下，好不容易吹散了，接种后好多细胞都不聚球了，估计是损伤太大挂掉了，各位有没有好的传代方法啊？谢了~

wgydys

1.加入tryple前用PBS洗三次。
% r* I/ D+ Y  S: X9 Z2 X9 M8 B. ?& r8 e2.细胞细胞打不散，可在tryple中加入2%EDTA,应该可以打散细胞，不要强力吹打。

zsc78

同意楼上意见：首先你没有用PBS或HBSS漂洗，培养液或血清中和胰酶的部分活性；个人经验好像胰酶+EDTA的消化液的消化能力比tryple强，tryple好像相对温和些。

lujn100

回复 3# zsc78 / f$ B7 f1 \0 [; J: Y6 u
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0 g. T# f/ I1 S1 r    谢谢哦~* V, P8 ?5 X2 ]5 |# |
    我的培养基里是不加血清的，用你的方法大概需要消化多长时间呢？我用普通胰酶接种原代细胞时消化5min，发现细胞基本都贴壁了，分化出好多小胶质，是不是消化太厉害了，所以我现在都不敢用普通胰酶了....

lujn100

回复 2# wgydys # p7 N$ @( P. s8 |* Z3 L# V2 k# x

" y  H% m3 x& S& q3 q
, [8 @; n& p/ W    用pbs反复洗，会不会对细胞损伤太大啊？而且我的培养基里都没有血清的，你在传代的时候一般吹多少下可以吹散啊？

wgydys

消化时间长短需要根据镜下观察决定，只要细胞间连接带明显可见和粗大即可，每种细胞的消化时间不一样。

get0715

回复 6# wgydys ) a1 R" a& Z- C- t
; X0 Y4 T$ y3 c& q" D
神经球不是贴壁细胞，看不见消化程度。如果细胞有突起贴壁，细胞很可能就已经分化了。

get0715

神经球的传代问题确实不太好解决，你根据自己的实验做一组消化时间的梯度实验吧，相同多的细胞，加入相同浓度的酶消化，1分钟为梯度，看哪种最容易消化为单细胞，并且活性好不容易贴壁分化。

guojingjing

回复 4# lujn100 . P1 _. A1 Z; X( [  F) r
' r- D# a8 s2 t3 l

' a% V1 G+ J2 D+ A    神经干细胞还能分化出小胶质细胞？小胶质细胞不是起源于骨髓吗？在发育过程中从外周进入脑内的

luckydog

用0.025%的胰酶-EDTA消化神经球